{{'Search' | translate}}
 

Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical

Company: Fisher Scientific
Catalog#: S271-10
Bio-protocol()
Company-protocol()
Other protocol()

Extraction and Quantification of Polyphosphate (polyP) from Gram-negative Bacteria
Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract]  Polyphosphate (polyP), a universally conserved biomolecule, is composed of up to 1,000 phosphate monomers linked via phosphoanhydride bonds. Reaching levels in bacteria that are in the high nmoles per mg protein range, polyP plays important roles in biofilm formation and colonization, general stress protection and virulence. Various protocols for the detection of polyP in bacteria have been reported. These methods primarily differ in the ways that polyP is extracted and/or detected. Here, we report an improved method, in which we combine polyP extraction via binding to glassmilk with a very sensitive PolyP kinase/luciferase-based detection system. By using this procedure, we significantly enhanced the sensitivity of polyP detection, making it potentially applicable for mammalian tissues. [摘要]  多磷酸盐(polyP)是一种普遍保守的生物分子,由多达1,000个通过磷酸酐键连接的磷酸盐单体组成。 达到每毫克蛋白质高纳摩尔细菌的水平,polyP在生物膜形成和定植,一般应力保护和毒力中起重要作用。 已经报道了用于检测细菌中polyP的各种方案。 这些方法主要在于提取和/或检测polyP的方式不同。 在这里,我们报告了一种改进的方法,其中我们结合polyP提取通过结合到玻璃奶与非常敏感的PolyP激酶/荧光素酶检测系统。 通过使用该程序,我们显着增强了polyP检测的灵敏度,使其可能适用于哺乳动物组织。

【背景】聚磷酸盐(polyP)是一种由多达1,000种无机磷酸盐单体的直链组成的生物聚合物,存在于生命的所有三个领域的细胞中。然而,细菌是唯一已经充分研究了polyP代谢酶的生物。将ATP转化为polyP的细菌polyP激酶(PPK)催化正向和反向反应。虽然polyP的合成显然是细胞中有利的反应,但通过在体外提供足够量的ADP ,该酶可用于从polyP产生ATP,使得基于荧光素酶的ATP检测成为可能(Ault -Riché et al。,1998)。缺乏PPK的细菌在生物膜形成,运动性,持久性和各种应激反应方面存在缺陷,并显示出对次卤酸(即,漂白)应激或磷酸盐饥饿的显着增加的敏感性(图1)(Rao et al。,2009; Gray et ...

Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract]  This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.


Figure 1. Timeline of activities for the heterologous expression and purification of Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) from Escherichia coli
[摘要]  该协议提供了分步说明(图1),用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a(以前称为Cpf1)。 它还包括一个高纯度纯化方案,并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化,并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。

“”src
图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a(FnCas12a)的活动时间表

【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA(crRNA)作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护(van der Oost等人,2014; Marraffini ,2015)。 1类CRISPR-Cas系统(包含I型,III型和IV型)通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物,而2类系统(包含II型,V型和VI型)依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰(Mohanraju et al。 2016年)。

...

FRET-based Stoichiometry Measurements of Protein Complexes in vitro
Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract]  For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET signal. This approach allows us to assess complex stoichiometry in solution. [摘要]  为了全面了解生化反应,复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而,测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区,其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化,保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET(荧光共振能量转移),并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。

【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此,复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法,多角度光散射,分析超速离心,其能够提供粒子的精确分子量。但是,这些方法被认为是次要的。

基于FRET(荧光共振能量转移)的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区(Huang,1982),可以用较少的材料进行,更适合研究任何复杂的地层,与两种成分的大小无关。在该测定中,样品保持恒定的总蛋白质浓度,但两种组分之间的摩尔比连续变化(图1)。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。

这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记,所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的(D'Arcy等人,2013; ...

Comments