| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
|
|
|
| Bacterial Aggregation Assay in the Presence of Cyclic Lipopeptides
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Lipopeptides is an important class of biosurfactants having antimicrobial and anti-adhesive activity against pathogenic bacteria. These include surfactin, fengycin, iturin, bacillomycin, mycosubtilin, lichenysin, and pumilacidin (Arima et al., 1968; Naruse et al., 1990; Yakimov et al., 1995; Steller and Vater, 2000; Roongsawang et al., 2002; Vater et al., 2002). To date, none of these lipopeptides have been reported to possess any anti-motility activity. We isolated, purified and characterized two novel cyclic lipopeptides (CLPs) from Bacillus sp. 176 using high performance liquid chromatography, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. CLPs dramatically suppress the motility of pathogenic bacterium Vibrio ...
[摘要] 脂肽是一类重要的生物表面活性剂，对致病菌具有抗菌和抗粘连活性。这些包括表面活性肽，fengycin，伊库菌素，杆菌霉素，mycosubtilin，地衣素和pumilacidin（Arima等人，1968; Naruse等人，1990; Yakimov等人1995; Steller和Vater，2000; Roongsawang等人，2002; Vater等人，2002）。迄今为止，这些脂肽都没有被报道具有任何抗运动活性。我们从芽孢杆菌分离，纯化和鉴定了两种新的环状脂肽（CLPs）。 176使用高效液相色谱，质谱和核磁共振光谱。 CLPs极大地抑制致病性溶藻弧菌的运动，并促进细胞聚集而不诱导细胞死亡。根据Dalili所述用于抗生物膜测定的方法进行细胞聚集测定（Dalili等人，2015）。将来，该测定法可以适用于测试来自细菌的脂肽样活性物质的细胞聚集和抗生物膜活性。
【背景】过度使用广谱抗生素和随之而来的抗药性细菌的增殖刺激了开发环境友好型生物防治措施的努力，以减少健康危害和环境污染（Nam等人，2016; Sajitha >等。，2016）。近年来，生物表面活性剂的抗微生物特性已被越来越多地用于抗菌，抗真菌和抗病毒的应用（Cameotra和Makkar，2004; Singh和Cameotra，2004; Rodrigues等人 ...
|
|
|
| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
|
|
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or restriction site loss.
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
|
|
|