| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo protein into transport vesicles at the TGN under specific experimental conditions.
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| Isolation and Culture of Mouse Lung ILC2s
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Author:
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2018-10-05
[Abstract] Group 2 Innate Lymphoid Cells (ILC2) play an important role in immune responses at barrier surfaces, notably in the lung during airway allergic inflammation or asthma. Several studies have described methods to isolate ILC2s from wild-type naive mice, most of them using cell sorting to obtain a pure population. Here, we describe in detail, a simple, efficient method for isolation and culture of lung mouse ILC2s. Lungs from Rag2-/- mice pretreated with IL-33 are collected and processed into single cell suspensions. Lymphoid cells are then recovered by density gradient separation. Lin-CD45+ cells are selected by depletion of lineage positive cells followed by positive selection of CD45+ cells. Culture of the isolated cells for several days ...
[摘要] 第2组先天性淋巴细胞（ILC2）在屏障表面，特别是在气道过敏性炎症或哮喘期间的肺中的免疫应答中起重要作用。一些研究已经描述了从野生型幼稚小鼠中分离ILC2的方法，其中大多数使用细胞分选来获得纯种群。在这里，我们详细描述了一种简单有效的肺小鼠ILC2分离和培养方法。收集用IL-33预处理的 Rag2 - / - 小鼠的肺并加工成单细胞悬浮液。然后通过密度梯度分离回收淋巴样细胞。通过耗尽谱系阳性细胞然后阳性选择CD45 + 细胞来选择Lin - CD45 + 细胞。将分离的细胞培养数天导致高度纯化的ILC2群体表达典型的细胞表面标志物（CD90.2，Sca1，CD25，CD127和IL-33R）。这些细胞可在培养物中扩增长达10天，并用于多种离体测定或体内过继转移实验。
【背景】第2组先天性淋巴细胞（ILC2）是组织驻留细胞，其在抗寄生虫先天免疫以及过敏性炎症的发展中起关键作用。它们通过产生大量的2型细胞因子IL-5和IL-13对上皮细胞衍生的细胞因子如白细胞介素-33（IL-33）起反应，后者又诱导嗜酸性粒细胞增多和粘液产生（Cayrol和Girard，2018）。为了更好地表征这些细胞的功能和调节，许多组通过荧光激活细胞分选（FACS）从野生型小鼠（WT）的肺中分选ILC2。由于稳定状态下肺中存在的ILC2数量较少，因此该方法导致纯化细胞的产量较低（每只小鼠1×10 ...
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| In planta Transcriptome Analysis of Pseudomonas syringae
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Profiling bacterial transcriptome in planta is challenging due to the low abundance of bacterial RNA in infected plant tissues. Here, we describe a protocol to profile transcriptome of a foliar bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, in the leaves of Arabidopsis thaliana at an early stage of infection using RNA sequencing (RNA-Seq). Bacterial cells are first physically isolated from infected leaves, followed by RNA extraction, plant rRNA depletion, cDNA library synthesis, and RNA-Seq. This protocol is likely applicable not only to the A. thaliana–P. syringae pathosystem but also to different plant-bacterial combinations.
[摘要] 由于受感染植物组织中细菌RNA的丰度低，因此在植物中分析细菌转录组具有挑战性。 在这里，我们描述了一个描述叶子细菌病原体转录组的协议， Pseudomonas syringae pv。 番茄 DC3000，在感染早期的拟南芥叶中使用RNA测序（RNA-Seq）。 首先从感染的叶子中物理分离细菌细胞，然后进行RNA提取，植物rRNA消耗，cDNA文库合成和RNA-Seq。 该协议不仅适用于 A.拟南芥-P。 syringae 病理系统，但也适用于不同的植物 - 细菌组合。
【背景】植物已经进化出先天免疫系统以抵御病原体攻击。在过去的几十年中，已经深入研究了病原体识别和免疫信号传导途径的分子机制。然而，植物免疫如何影响病原体代谢以抑制病原体生长几乎不被理解，因为在植物中分析病原体反应很困难。在细菌病原体的情况下，植物叶内的转录组分析很难研究，因为细菌mRNA的量远低于植物的数量;由于植物中细菌的人口密度低，在感染的早期阶段尤其具有挑战性。为克服这一局限性，我们建立了一种从感染的植物叶片中分离细菌并用RNA-Seq分析细菌转录组的方法。该方法已成功用于分析模型细菌病原体 Pseudomonas syringae pv的转录组。 番茄 DC3000在模式植物 Arabidopsis thaliana 中的各种条件下（Nobori et al。，2018）. ...
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