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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein recruitment, we have utilised both camelid-derived VHH domain nanobodies as well as synthetic polypeptide monobodies based on the human type III fibronectin domain (Sha et al., 2013; Fridy et ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白（POI）的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹（AdPROM）系统（Fulcher等人，2016和2017）。 AdPROM由Von Hippel Lindau（VHL）蛋白组成，Cullin 2 E3连接酶底物受体（Bosu and Kipreos，2008），与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂（如骆驼科纳米抗体）缀合。当在细胞中引入时，靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集，我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体（Sharm等人，2013; Fridy等人。，2014; Schmidt et al。，2016）。在此协议中，我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征，并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性，这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联，而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。
【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计，构建和表达AdPROM VHL-nano ...
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