| Magnetic Resonance Imaging and Histopathological Visualization of Human Dural Lymphatic Vessels
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] In this protocol, we describe a method to visualize and map dural lymphatic vessels in-vivo using magnetic resonance imaging (MRI) and ex-vivo using histopathological techniques. While MRI protocols for routine imaging of meningeal lymphatics include contrast-enhanced T2-FLAIR and T1-weighted black-blood imaging, a more specific 3D mapping of the lymphatic system can be obtained by administering two distinct gadolinium-based MRI contrast agents on different days (gadofosveset and gadobutrol) and subsequently processing images acquired before and after administration of each type of contrast. In addition, we introduce methods for optimal immunostaining of lymphatic and blood vessel markers in human dura mater ex-vivo.
[摘要] 在该协议中，我们描述了一种使用组织病理学技术使用磁共振成像（MRI）和体外可视化和绘制硬膜淋巴管体内的方法。 虽然用于脑膜淋巴管的常规成像的MRI方案包括对比增强的T2-FLAIR和T1加权的黑血成像，但是可以通过在不同日期施用两种不同的基于钆的MRI造影剂来获得更具体的淋巴系统3D图谱 （gadofosveset和钆布醇）并且随后处理在施用每种类型的对比之前和之后采集的图像。 此外，我们介绍了在人体硬脑膜内进行淋巴和血管标志物最佳免疫染色的方法。
【背景】在大脑免疫特权的原因是没有实质淋巴管。 然而，最近的研究发现了啮齿动物硬脑膜中广泛的淋巴循环系统（Aspelund等人，2015; Louveau等人，2015），提供了可能的途径 用于消除大脑的废物和免疫细胞进入深部颈部淋巴结。 在这个协议中，我们描述了一种方法来：（1）使用MRI的头部显示硬脑膜内的淋巴管体内，和（2）使用优化评估淋巴管的局部存在 免疫染色方法（Absinta等人，2017）。 淋巴管的体内成像可以更详细地研究废物清除和免疫功能的机制及其在各种疾病和衰老中的潜在异常。
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| Proximal Ligation Assay (PLA) on Lung Tissue and Cultured Macrophages to Demonstrate Protein-protein Interaction
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] In this protocol, we describe proximal ligation assay (PLA), an antibody-based detection method for protein-protein interaction. This method relies on specific binding of individual primary antibodies to the two putative interacting proteins. The primary antibodies need to have different hosts. The secondary antibodies against the two hosts have complementary oligonucleotide moieties attached to them. If the two antigens are in close proximity (presumably interacting with each other), the complementary oligonucleotides can anneal and fluorescent nucleotides can be incorporated in a single DNA polymerization step. Under a microscope, these reactions appear as punctate fluorescent spots, indicating successful PLA reaction and suggesting protein-protein interaction between the two antigens.
[摘要] 在这个协议中，我们描述近端连接测定（PLA），一种基于抗体的蛋白质相互作用检测方法。 这种方法依赖于个别一抗与两个推定的相互作用蛋白的特异性结合。 一抗需要有不同的宿主。 针对两种宿主的二抗具有与其连接的互补的寡核苷酸部分。 如果两种抗原紧密接近（推测彼此相互作用），则互补的寡核苷酸可以退火，并且荧光核苷酸可以并入单个DNA聚合步骤中。 在显微镜下，这些反应表现为点状荧光斑点，表明成功的PLA反应并提示两种抗原之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
【背景】近端连接测定法（PLA）是基于抗体的技术，以确定两种蛋白质是否彼此具有40nm。以这种方式检测到的蛋白质可以通过荧光来识别（Ho等人，2012; Banerjee等人，2015）。这使得PLA成为定位蛋白质 - 蛋白质相互作用的极好工具。 Toll样受体（TLR）途径的激活是致病性威胁的先天性免疫应答的重要组成部分。 TLR识别病原体相关分子并诱导信号级联以实现对感染的快速响应。 TLR2和TLR4是TLR家族的两个研究得非常好的成员，它们对不同的刺激有反应。尽管两种受体都响应细菌感染而激活，但只有TLR4响应脂多糖暴露。它们激活一些共享的信号级联，但包括MyD88 / Traf6通路。该途径的诱导包括形成被称为myddosome的信号复合物（Gay等人，2011; Xiong等人，2011; ...
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