| Immuno-electrophysiology on Neuromuscular Junctions of Drosophila Third Instar Larva
|
|
Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Alterations in synaptic transmission are critical early events in neuromuscular disorders. However, reliable methodologies to analyze the functional organization of the neuromuscular synapses are still needed. This manuscript provides a detailed protocol to analyze the molecular assembly of the neuromuscular synapses through immune-electrophysiology in Drosophila melanogaster. This technique allows the quantification of the molecular behavior of the neuromuscular synapses by correlating the structural configuration of the synaptic boutons with their electrical activity.
[摘要] [摘要]突触传递的改变是神经肌肉疾病的关键早期事件。但是，仍然需要可靠的方法来分析神经肌肉突触的功能组织。此马努脚本提供了详细的协议，通过在免疫电分析神经肌肉突触的分子组装果蝇黑腹果蝇。该技术通过使突触钮扣的结构构型与其电活动相关联，可以量化神经肌肉突触的分子行为。
[背景]果蝇三龄幼虫的神经肌肉接头（NMJ）的功能组织在研究突触形成和功能的分子机制方面具有突出的优势（Feiguin等，2009 ; Godena等，2011; Romano等。（2014年和2015年；Strah等人，2020年），它在包括人类在内的其他物种中似乎是保守的。在这方面，果蝇NMJs的解剖组织是由多个突触钮扣构成的，这些突触钮扣是在运动轴突的最终乔木形成的。这些结构的分化和维持负责骨骼肌的神经支配，并暗示不同分子的协调作用，专门用于建立细胞接触以及释放，接收和整合神经递质信号传导所需的机制。此外，在果蝇中开发的功能强大的遗传工具以及神经系统对单个神经元的解剖学解析，提供了难得的机会，可以在可区分细胞的组织中进行全基因组范围的分子表型无偏搜索。尽管果蝇已经存在可视化神经肌肉突触建立的单独协议（Sabeva和Bykhovskaia，2017 ; Goel等人，2019 ...
|
|
|
| FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] We developed a protocol for photoconversion of endocytic marker FM1-43 followed by electron microscopy analysis of synaptic boutons at the Drosophila neuromuscular junction. This protocol allows detection of stained synaptic vesicle even when release rates are very low, such as during the spontaneous release mode. The preparations are loaded with the FM1-43 dye, pre-fixed, treated and illuminated to photoconvert the dye, and then processed for conventional electron microscopy. This procedure enables clear identification of stained synaptic vesicles at electron micrographs.
[摘要] 我们开发了内吞标记FM1-43的光转换方案，然后在果蝇神经肌肉接头处进行突触引物的电子显微镜分析。 即使在释放速率非常低时，例如在自发释放模式期间，该方案允许检测染色的突触小泡。 该制剂装载有FM1-43染料，经预先固定，处理和照射，以使染料转变为染料，然后进行常规电子显微镜处理。 该方法能够在电子显微照片下清楚鉴定染色的突触小泡。
【背景】神经元发射体通过突触小泡与神经元质膜的融合而释放。囊泡可以自发融合或响应动作电位。随后，囊泡通过内吞作用获得回收。通过分子生物学，电生理学和显微镜的工具广泛研究了突触小泡回收的分子机制（Slepnev和De Camilli，2000; Sudhof，2004; Rizzoli和Betz，2005; Kavalali，2006）。加载内参标记FM1-43与染料光转换耦合，然后进行电子显微镜分析是一种强大的技术，允许调查和测量回收囊泡池（Harata et al。，2001; Schikorski and Stevens，2001; Rizzoli和Betz， 2004）。果蝇神经肌肉接头（NMJ）是具有明确定义的突触引物的有利制剂，其能够快速产生具有突变突触蛋白的细胞系和严格评估囊泡回收池（Akbergenova和Bykhovskaia，2009; ...
|
|
|
| Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles
|
|
Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] Eukaryotic cells adapt to changes in external or internal signals by precisely modulating the expression of specific gene products. The expression of protein-coding genes is controlled at the transcriptional and post-transcriptional levels. Among the latter steps, the regulation of translation is particularly important in cellular processes that require rapid changes in protein expression patterns. The translational efficiency of mRNAs is altered by RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding (nc)RNAs such as microRNAs (Panda et al., 2014a and 2014b; Abdelmohsen et al., 2014). The impact of factors that regulate selective mRNA translation is a critical question in RNA biology. Polyribosome (polysome) fractionation analysis is a powerful method to assess the association of ...
[摘要] 真核细胞通过精确调节特定基因产物的表达来适应外部或内部信号的变化。蛋白质编码基因的表达受到转录和转录后水平的控制。在后面的步骤中，翻译的调节在需要蛋白质表达模式快速变化的细胞过程中特别重要。 mRNA的翻译效率由RNA结合蛋白（RBP）和非编码（nc）RNA如微RNA（Panda等人，2014a和2014b; Abdelmohsen等人）改变2014）。调节选择性mRNA翻译的因素的影响是RNA生物学中的一个关键问题。多核糖体（多核糖体）分馏分析是评估核糖体与给定mRNA的关联的有效方法。它提供了关于该mRNA的翻译状态的有价值的信息，这取决于与它们相关联的核糖体的数目，并且鉴定未翻译的mRNA（Panda等人，2016）。与许多核糖体相关的mRNA形成大量的多核糖体，预计将被主动翻译，而与少数或没有核糖体相关的mRNA有可能翻译不佳。总之，多聚糖分馏分析允许直接测定整个转录组水平的翻译效率以及个体mRNA。
背景 ...
|
|
|