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Date:
2018-07-05
[Abstract] In this protocol, we describe how to quantify starch in guard cells of Arabidopsis thaliana using the fluorophore propidium iodide and confocal laser scanning microscopy. This simple method enables monitoring, with unprecedented resolution, the dynamics of starch in guard cells.
[摘要] 在该方案中，我们描述了如何使用荧光团碘化丙啶和共聚焦激光扫描显微镜来量化拟南芥保卫细胞中的淀粉。 这种简单的方法能够以前所未有的分辨率监测保卫细胞中淀粉的动态变化。
【背景】淀粉是葡萄糖的复合聚合物，代表植物储存碳水化合物的最丰富形式。淀粉根据其衍生的细胞类型和外部环境条件提供不同的功能。在控制水和二氧化碳与环境交换的气孔中边界的保卫细胞中，淀粉可在转变为光的几分钟内动员，有助于产生有机酸和糖，从而增加保卫细胞膨胀并促进气孔开放。在叶肉细胞中，淀粉通常在白天逐渐积累，并在夜间降解以支持代谢（Santelia和Lunn，2017）。
因为保卫细胞仅占总叶的一小部分，所以难以使用常规方法定量测量淀粉。到目前为止，保卫细胞中的淀粉积累主要通过碘染色显现。该技术可以确定淀粉的存在/不存在，但不能提供准确的定量信息。
在这里，我们描述了一种基于荧光的成像方法来量化拟南芥保护细胞中的淀粉。该技术基于细胞壁材料和其他葡聚糖底物（包括淀粉）与荧光假席夫试剂碘化丙啶（PS-PI）的共价标记。用高碘酸处理分离的表皮，以将葡萄糖单元的羟基氧化成醛和酮基团。然后醛基（-CHO）可以与碘化丙锭共价反应，产生具有高荧光葡聚糖的样品，非常适合于共聚焦激光扫描显微镜。保卫细胞叶绿体中单个淀粉颗粒的面积可以使用数字成像来确定。我们应用这种方法来评估完整的拟南芥叶片的保护细胞中的淀粉含量在昼夜循环中的动态变化，并确定fusicoccin（质子泵的化学活化剂）对淀粉量的影响。分离表皮的保卫细胞剥离漂浮在气孔开放缓冲液中的碎片（Horrer ...
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