| In vitro Differentiation of Human iPSC-derived Cardiovascular Progenitor Cells (iPSC-CVPCs)
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Induced pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitor cells (iPSC-CVPCs) provide an unprecedented platform for examining the molecular underpinnings of cardiac development and disease etiology, but also have great potential to play pivotal roles in the future of regenerative medicine and pharmacogenomic studies. Biobanks like iPSCORE ( Stacey et al., 2013; Panopoulos et al., 2017), which contain iPSCs generated from hundreds of genetically and ethnically diverse individuals, are an invaluable resource for conducting these studies. Here, we present an optimized, cost-effective and highly standardized protocol for large-scale derivation of human iPSC-CVPCs using small molecules and purification using metabolic selection. We have successfully applied this protocol ...
[摘要] [摘要 ] 诱导性多能干细胞衍生的心血管祖细胞（iPSC-CVPCs）为检查心脏发育和疾病病因的分子基础提供了前所未有的平台，但在再生医学和药物基因组学的未来中也具有重要作用。像iPSCORE这样的生物库（Stacey 等，2013 ；Panopoulos 等，2017）， 其中包含由数百个遗传和种族不同的个体产生的iPSC，是进行这些研究的宝贵资源。在这里，我们为小分子大规模衍生人iPSC-CVPCs和代谢选择纯化提供了一种优化，具有成本效益和高度标准化的方案。我们已经成功地应用了该协议，从154种不同的iPSCORE iPSC品系中获得了iPSC-CVPC，从而获得了大量的高纯度心脏细胞。一个重要的我们的协议的组成部分是Ç ELL Ç onfluency 估计S（ccEstimate ），用于估计当iPSC集单层将达到80％汇合，这是用于发起的iPSC-CVPC推导最佳的时间的自动方法，并且使得协议为易于在具有不同增长率的iPSC系列中使用。此外，我们发现跨iPSC-CVPC的细胞异质性是由于两种截然不同的心脏细胞类型（心肌细胞（CMs）和心外膜衍生细胞（EPDCs））的比例不同导致的，这两种细胞在心脏再生中均具有关键作用。该协议消除了iPSC线到线优化的需要，并且可以轻松地进行调整和扩展，以进行高通量研究或生成大量适用于再生医学应用的细胞。
[背景 ] ...
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| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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| Investigating Neural Stem Cell and Glioma Stem Cell Self-renewal Potential Using Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA)
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Glioma stem cells (GSC) grown as neurospheres exhibit similar characteristics to neural stem cells (NSC) grown as neurospheres, including the ability to self-renew and differentiate. GSCs are thought to play a role in cancer initiation and progression. Self-renewal potential of GSCs is thought to reflect many characteristics associated with malignancy, including tumor recurrence following cytotoxic therapy due to their proliferative dormancy and capacity to allow for the development of resistant tumor cell sub-clones due to mutations acquired during their differentiation. Here, we demonstrate that using extreme limiting dilution analysis (ELDA), subtle differences in the frequency of sphere-forming potential between PI3K-mutant oncogenic NSCs and non-oncogenic NSCs can be measured, in ...
[摘要] 作为神经球生长的神经胶质干细胞（GSC）表现出与作为神经球生长的神经干细胞（NSC）相似的特征，包括自我更新和分化的能力。 GSC被认为在癌症的发生和发展中起作用。 GSC的自我更新潜力被认为反映了与恶性肿瘤相关的许多特征，包括细胞毒性治疗后的肿瘤复发，这是由于它们的增殖性休眠和由于在其分化期间获得的突变而允许产生抗性肿瘤细胞亚克隆的能力。在这里，我们证明使用极限稀释分析（ELDA），可以测量PI3K-突变致癌NSCs和非致癌NSCs之间的球形成潜力频率的细微差异体外。我们进一步展示了ELDA如何在强制分化之前和之后用于细胞，以放大突变体和对照NSCs之间的球形成潜力的固有差异。最终，ELDA利用单个或少数种子干细胞自我更新，分裂和形成神经球的能力差异。重要的是，该测定还允许在不同条件下在遗传上不同的细胞之间或相同细胞之间进行比较，其中可以测试靶特异性药物或其他新型癌症干细胞疗法的影响。
【背景】胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的脑癌之一，预后极差（Kaye和Morokoff，2014）。 ...
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