| Separation and Purification of Glycosaminoglycans (GAGs) from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The nematode Caenorhabditis elegans is a popular model organism for studies of developmental biology, neurology, ageing and other fields of basic research. Because many developmental processes are regulated by glycosaminoglyans (GAGs) on cell surfaces and in the extracellular matrix, methods to isolate and analyze C. elegans GAGs are needed. Such methods have previously been optimized for other species such as mice and zebrafish. After modifying existing purification protocols, we could recently show that the nematodes also produce chondroitin sulfate, in addition to heparan sulfate, thus challenging the view that only non-sulfated chondroitin was synthesized by C. elegans. We here present our protocol adapted for C. elegans. Since the purification ...
[摘要] 线虫秀丽隐杆线虫是研究发育生物学，神经学，衰老等基础研究领域的流行模型生物。 因为许多发育过程由细胞表面和细胞外基质中的糖胺聚糖（GAG）调节，分离和分析C的方法。 线虫需要GAG。 此类方法先前已针对其他物种如小鼠和斑马鱼进行了优化。 在修改现有的纯化方案后，我们最近可以显示除了硫酸乙酰肝素外，线虫也产生硫酸软骨素，因此挑战了仅通过C合成非硫酸软骨素的观点。线虫。 我们在这里介绍我们适用于C的协议。线虫。 由于净化策略涉及非硫酸化和硫酸化GAG的分离，所以对于其他可能有利的方法也是有用的。
【背景】糖胺聚糖（GAG）是重复二糖单元的直链多糖链，其通常被硫酸根取代。除了透明质酸，其是在质膜上合成而不被锚定到任何蛋白质的非硫酸化GAG，所有其他GAG都与核心蛋白共价连接，从而形成蛋白聚糖（PG）。在PG上发现的最常见的GAG是硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素，含有N-乙酰基 - 葡糖胺和N，N-乙酰基 - 半乳糖胺，分别（张，2010）。在高尔基隔室的生物合成过程中，它们是非模板驱动的过程，它们经过多种修饰，包括将葡萄糖醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸，并在不同位置硫酸化（Bulow和Hobert，2006; ...
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| Producing GST-Cbx7 Fusion Proteins from Escherichia coli
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] This protocol describes the production of GST-Cbx7 fusion proteins from E. coli, originally developed in the recent publication (Zhen et al., 2016). The pGEX-6P-1-GST plasmids encoding the Cbx7 variants were transformed into BL21 competent cells. The fusion protein production was induced by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside and they were purified by Glutathione Sepharose 4B. This protocol can be adapted for the purification of other proteins.
[摘要] 该方案描述了最近在最近的出版物（Zhen等，2016）中开发的大肠杆菌GST-Cbx7融合蛋白的生产。 将编码Cbx7变体的pGEX-6P-1-GST质粒转化到BL21感受态细胞中。 通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导融合蛋白的产生，并用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化。 该方案可以适用于其他蛋白质的纯化。
【背景】Polycomb组（PcG）蛋白通过调节高阶染色质结构调节基因表达（Kerppola，2009; Simon和Kingston，2013）。 PcG蛋白通常存在于两种主要复合物Polycomb镇压复合物（PRC）1和2（Kerppola，2009; Simon和Kingston，2013）中。 PRC2是甲基转移酶，其催化组蛋白H3（H3K27me2 / 3）上赖氨酸27的二甲基和三甲基化（Cao等，2002）; PRC1是在赖氨酸119（H2AK119Ub）上单核苷酸组氨酸H2A的泛素连接酶（Wang等，2004）。哺乳动物PRC1复合物进一步分为典型和变体PRC1（Gao等，2012，Tavares等，2012）。规范PRC1由每个Ring1（Ring1A / Ring1B），Pcgf（Mel18 / Bmi1），Phc（Phc1 / 2/3）和Cbx（Cbx2 / 4/6/7/8）蛋白之一组成。 ...
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| DNA-free Genome Editing of Chlamydomonas reinhardtii Using CRISPR and Subsequent Mutant Analysis
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] We successfully introduced targeted knock-out of gene of interest in Chlamydomonas reinhardtii by using DNA-free CRISPR. In this protocol, the detailed procedures of an entire workflow cover from the initial target selection of CRISPR to the mutant analysis using next generation sequencing (NGS) technology. Furthermore, we introduce a web-based set of tools, named CRISPR RGEN tools (http://www.rgenome.net/), which provides all required tools from CRISPR target design to NGS data analysis.
[摘要] 我们通过使用无DNA的CRISPR成功地引入了目标克隆在赖氨酸衣藻中的目标基因敲除。在该协议中，整个工作流程的详细过程涵盖从初始目标选择CRISPR到使用下一代测序（NGS）技术的突变体分析。此外，我们介绍一种基于Web的工具集，名为CRISPR RGEN工具（ http：// www.rgenome.net/ ），其中提供了CRISPR目标设计到NGS数据分析的所有必需工具。
背景 我们最近报道（Baek等人，2016），使用预先组装的Cas9蛋白质指导RNA核糖核蛋白，模型绿色微藻（Chlamydomonas ...
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