| Structural Analysis of Target Protein by Substituted Cysteine Accessibility Method
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) is a biochemical approach to investigate the water accessibility or the spatial distance of particular cysteine residues substituted in the target protein. Protein topology and structure can be annotated by labeling with methanethiosulfonate reagents that specifically react with the cysteine residues facing the hydrophilic environment, even within the transmembrane domain. Cysteine crosslinking experiments provide us with information about the distance between two cysteine residues. The combination of these methods enables us to obtain information about the structural changes of the target protein. Here, we describe the detailed protocol for structural analysis using SCAM.
[摘要] 取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生物化学方法，用于研究目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性或空间距离。蛋白质拓扑和结构可以通过用甲硫代磺酸盐试剂标记来注释，所述甲硫基磺酸盐试剂特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应，甚至在跨膜结构域内。半胱氨酸交联实验为我们提供了关于两个半胱氨酸残基之间距离的信息。这些方法的组合使我们能够获得有关靶蛋白结构变化的信息。在这里，我们描述了使用SCAM进行结构分析的详细协议。
【背景】结构分析提供了关于靶蛋白功能的关键信息。 X射线晶体学和核磁共振已被用作生物学领域中的高分辨率蛋白质结构分析方法。然而，这些方法需要以非常高的浓度从膜中提取的纯化蛋白质用于膜蛋白的结构分析。取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生化方法，用于分析目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性和空间距离。使用特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应的甲硫代磺酸盐（MTS）试剂，我们可以注释目标蛋白的拓扑结构和结构。由于标记试剂 N - 生物素氨基乙基甲硫基磺酸盐（MTSEA-生物素）对质膜是不可渗透的（Seal et ...
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| Virucidal and Neutralizing Activity Tests for Antiviral Substances and Antibodies
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] In a narrow definition, virucidal activity represents the activity by which to interact with and physically disrupt viral particles. In a broad definition, it includes the activity by which to functionally inhibit (neutralize) viral infectivity without apparent morphological alterations of the viral particles. The viral infectivity can be measured in cell culture system by means of plaque assay, infectious focus assay, 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay, etc. Morphologically, disruption of viral particles can be demonstrated by negative staining electron microscopic analysis of viral particles. In this article, we describe methods to assess virucidal activity in a broad definition.
[摘要] 在狭义定义中，杀病毒活性表示与病毒颗粒相互作用和物理破坏的活性。 在一个广义的定义中，它包括了功能上抑制（中和）病毒感染性而没有病毒颗粒的明显形态改变的活性。 可以通过噬菌斑测定，感染性聚焦测定，50％组织培养感染剂量（TCID 50）测定，等等在细胞培养系统中测量病毒感染性。 形态学上，病毒颗粒的破坏可以通过病毒颗粒的负染色电子显微镜分析来证明。 在这篇文章中，我们描述了用广义定义评估杀病毒活性的方法。
【背景】病毒是细胞内寄生虫，它们劫持宿主细胞机制来复制它们自己的基因组。在病毒生命周期的最初阶段，感染性病毒颗粒附着（结合）到靶细胞表面上的称为病毒受体的特定宿主蛋白，然后病毒渗透（内化和/或融合）到细胞的细胞内区室宿主细胞，其中病毒生命周期的后续步骤继续产生后代病毒体（Scheel和Rice，2013）。
狭义定义中的杀病毒活性表示与病毒颗粒相互作用和物理破坏的活性。在一个广义的定义中，它包括与病毒感染性相互作用并在功能上抑制（中和）病毒感染性而没有病毒颗粒的明显形态改变的活性，如抗体介导的中和的情况。
最近我们报道了从蛇毒（Chen等，2017）获得的分泌型磷脂酶Aβ的异构体和来自蝎毒（El-Bitar ...
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| Time-of-addition and Temperature-shift Assays to Determine Particular Step(s) in the Viral Life Cycle that is Blocked by Antiviral Substance(s)
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Viruses infect their host cells to produce progeny virus particles through the sequential steps of the viral life cycle, such as viral attachment, entry, penetration and post-entry events. This protocol describes time-of-addition and temperature-shift assays that are employed to explore which step(s) in the viral life cycle is blocked by an antiviral substance(s).
[摘要] 病毒通过病毒生命周期的连续步骤感染它们的宿主细胞以产生子代病毒颗粒，例如病毒附着，进入，穿透和进入后事件。 该协议描述了用于探索病毒生命周期中的哪个或哪些步骤被抗病毒物质阻断的添加时间（time-of-addition）和温度变化分析。
【背景】病毒是专门的细胞内寄生虫，它们劫持宿主细胞机制来复制它们自己的基因组。病毒的生命周期通过感染性病毒颗粒（病毒粒子）附着（结合）到宿主细胞表面并将其穿透（内化，融合）到细胞内区室中进行，其中病毒粒子脱壳（分解）发生，然后是病毒基因组转录/复制，病毒蛋白质合成和病毒体组装，最终导致感染细胞产生和释放子代病毒体（Scheel and Rice，2013）。
为了探索病毒生命周期的哪个或哪些步骤被抗病毒物质阻断，进行药物添加时间实验。简而言之，在病毒接种细胞的不同时间点将病毒和/或宿主细胞添加到病毒和/或宿主细胞中（Chen等人，2017）：（1）预处理在病毒接种前带有抗病毒物质的细胞检查该物质是否可以阻断病毒受体以抑制病毒与宿主细胞的附着或者是否可以诱导产生抗病毒宿主因子如干扰素。 （2）对病毒进行预处理，然后将处理过的病毒接种到细胞中，检查抗病毒物质的杀病毒活性或中和活性。 （3）病毒接种期间细胞和病毒的共同处理检查病毒进入步骤的抗病毒效果，包括杀病毒（中和）活性和阻断病毒附着和细胞渗透。 ...
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