| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Production of Labeled Probes for Single-molecule FISH or RNA Capture
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Arrays of short, singly-labeled ssDNA oligonucleotides enable in situ hybridization with single molecule sensitivity and efficient transcript specific RNA capture. Here, we describe a simple, enzymatic protocol that can be carried out using basic laboratory equipment to convert arrays of PCR oligos into smFISH and RAP probesets in a quantitative, cost-efficient and flexible way.
[摘要] 短的，单标记的ssDNA寡核苷酸阵列使得能够与单分子灵敏度和有效的转录物特异性RNA捕获进行原位杂交。 在这里，我们描述了一个简单的酶促协议，可以使用基本的实验室设备将PCR寡核苷酸阵列以定量，成本高效和灵活的方式转换为smFISH和RAP探针组。
【背景】合成来源的多个单标记的短寡核苷酸的使用极大地改进了对特异性转录物的高特异性和单分子灵敏度的检测（Femino等人，1998; Raj等人。，2008）。这种探针分子与经典使用的长核酸探针相比具有改进的穿透性并且需要更温和的杂交条件，从而更好地保存标本的结构（例如，Little等人 >，2015，Gaspar 等，2017a）。由于在该设计中多个寡核苷酸 - 通常24-96-靶向相同转录物的不同部分，因此在非特异性背景上在特异性靶分子上发生信号累积，这与由长的多标记探针产生的相等信号相反（Raj ，2008）。此外，由于单个短探针的标记是定量的 - 与长探针的随机标记相反 - ...
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| The RiboPuromycylation Method (RPM): an Immunofluorescence Technique to Map Translation Sites at the Sub-cellular Level
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] While isotopic labeling of amino acids remains the reference method in the field for quantifying translation rate, it does not provide any information on spatial localization of translation sites. The rationale behind developing the ribopuromycylation method (RPM) was primarily to map translation sites at the sub-cellular level while avoiding detection of newly synthesized proteins released from ribosomes. RPM visualizes actively translating ribosomes in cells via standard immunofluorescence microscopy in fixed and permeabilized cells using a puromycin-specific monoclonal antibody to detect puromycylated nascent chains trapped on ribosomes treated with a chain elongation inhibitor.
[摘要] 尽管氨基酸的同位素标记仍然是用于定量翻译速率的领域中的参考方法，但是其不提供关于翻译位点的空间定位的任何信息。 开发ribopuromycylation方法（RPM）的基本原理主要是在亚细胞水平上绘制翻译位点，同时避免检测从核糖体释放的新合成的蛋白质。 RPM通过使用嘌呤霉素特异性单克隆抗体的固定的和透化的细胞中的标准免疫荧光显微镜可视化主动翻译细胞中的核糖体以检测捕获在用链延长抑制剂处理的核糖体上的嘌呤化新生链。
【背景】几十年来，氨基酸的同位素标记被认为是研究蛋白质翻译的金标准。虽然这种方法已被证明是非常准确的评估翻译率，它没有提供翻译核糖体的位置信息。最近，氨基酸类似物使荧光检测新生链（Dieterich等人，2007）。然而，几乎所有检测到的信号都来自核糖体释放的多肽。我们最初的想法是开发一种方法来标记新生链，同时还束缚于翻译核糖体。
嘌呤霉素（PMY）是一种氨基糖苷类抗生素，模拟带电荷的tRNA Tyr并掺入核糖体A位点。因此，PMY通过核糖体催化 - ...
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