| In vitro Crosslinking Reactions and Substrate Incorporation Assays for The Identification of Transglutaminase-2 Protein Substrates
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Transglutaminase (TG2) catalyzes protein crosslinking between glutamyl and lysyl residues. Catalytic activity occurs via a transamidation mechanism resulting in the formation of isopeptide bonds. Since TG2-mediated transamidation is of mechanistic importance for a number of biological processes, assays that enable rapid and efficient identification and characterization of candidate substrates are an important first-step to uncovering the function of crosslinked proteins. Herein we describe an optimized and flexible protocol for in vitro TG2 crosslink reactions and substrate incorporation assays. We have previously employed these techniques in the identification of the protein high mobility group box 1 (HMGB1) as a TG2 substrate. However, the protocol can be adapted for ...
[摘要] [摘要]转谷氨酰胺酶(TG2)催化谷氨酰和赖氨酰残基之间的蛋白质交联。催化活性通过转酰胺机制发生，导致异肽键的形成。由于TG2介导的transamidation是一些生物过程的机械重要性，检测，使快速和有效的识别和表征的候选底物是一个重要的第一步，以揭示交联蛋白的功能。在这里，我们描述了一个优化和灵活的协议，用于体外TG2交联反应和底物结合测定。我们以前曾采用这些技术在鉴定蛋白质高流动性基团盒1（HMGB1）作为TG2底物。然而，该协议可以适应任何候选转酰胺化底物的鉴定。
[背景]转谷氨酰胺酶(TG2)是转谷氨酰胺酶家族的成员，催化钙依赖性转酰胺化反应。转谷氨酰胺酶家族包括TG1-7和FXIIIa，以及带4.2的非催化活性成员，在蛋白质支架中发挥作用(Satchwell等，2009；Gundemir等，2012)。TG2在该家族中的独特之处在于，它是无处不在的表达和多向性功能；除了蛋白交联外，TG2还具有蛋白二硫异构酶(Hasegawa等，2003；Mastroberardino等，2006)、G蛋白(Nakaoka等，1994；Baek等，1996；Vezza等，1999)和激酶(Mishra和Murphy，2004；Mishra等，2006和2007)的功能。
蛋白质交联发生在与肽结合的谷氨酰残基(谷氨酰胺供体底物)的γ-羧酰胺基与赖氨酰残基(赖氨酸受体底物)的ϵ-氨基基之间，从而形成ϵ-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键(Folk和Finlayson，1977)。交联反应的示意图如图1所示。 ...
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| Immunolabeling of Maize Meiocytes
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] This protocol describes a quick method for immunolocalization of meiotic proteins in maize. It includes a fixation step that allows for long-term storage of material and provides good preservation of chromatin structure.
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种在玉米中进行减数分裂蛋白免疫定位的快速方法。它包括一个固定步骤，可以长期保存材料并提供良好的染色质结构保存。
[背景] 卵母细胞是生殖细胞，在其中发生同源染色体配对，突触和重组的专门过程，然后染色体分离以产生单倍体核。阐明减数分裂蛋白的定位对于理解这些过程至关重要。尽管此协议可能有多种变体，但我们发现微波加热步骤对于使其可靠地工作于玉米中的免疫定位至关重要。
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| Rice Ragged Stunt Virus Propagation and Infection on Rice Plants
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Virus inoculation is a basic experimental procedure to evaluate the resistance of a rice variety or a transgenic material upon virus infection. We recently demonstrated that Rice Ragged Stunt Virus (RRSV), an oryzavirus that is transmitted by brown planthopper (BPH), can suppress jasmonic acid-mediated antiviral defense through the induction of microRNA319 and facilitate virus infection in rice. To verify this, we performed virus inoculation experiments on wild-type rice plants and miR319-TCP21-associated transgenic rice plants through a modified group inoculation method. Here, we presented the detailed procedure of RRSV propagation and infection process on rice plants.
[摘要] 病毒接种是评估水稻品种或转基因材料对病毒感染的抗性的基本实验程序。 我们最近证明，由褐飞虱（BPH）传播的 Rice Ragged Stunt Virus >（RRSV）是一种 oryzavirus >，可以通过诱导抑制茉莉酸介导的抗病毒防御 microRNA319并促进水稻中的病毒感染。 为了验证这一点，我们通过改良的组接种方法对野生型水稻植物和miR319-TCP21相关的转基因水稻植物进行了病毒接种实验。 在这里，我们介绍了水稻植物RRSV繁殖和感染过程的详细程序。
【背景】研究病毒发病机制和筛选抗病毒水稻品种已经在克服水稻病毒病和保持粮食安全方面做了大量工作。 在该领域中，病毒接种是评估转基因材料或水稻品种的抗性的必要且可靠的方法。 水稻粗糙特技病毒>（RRSV）可以在许多亚洲国家以持续繁殖的方式通过褐飞虱传播水稻褴褛特技病（Ling et al。>，1978; Hibino，1979）。 两种经典方法，包括单苗接种和组接种，已用于进行病毒接种实验（Zhang et al。>，2013）。 通过修改传统的群体接种方法，我们提供了一种与自然感染条件非常相似的便捷方法。
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