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Chloramphenicol

氯霉素

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: C0378
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Other protocol()

Purification of Soluble Recombinant Human Tau Protein from Bacteria Using Double-tag Affinity Purification
Author:
Date:
2018-11-20
[Abstract]  Dysfunction of the microtubule-associated protein Tau (encoded by the MAPT gene) has been implicated in more than twenty neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s. As such, the physiological and disease-relevant functions of Tau have garnered great interest in the research community. One barrier hampering investigations into the functions of Tau and the generation of pharmacological agents targeting Tau has been the difficulty of obtaining soluble Tau protein in purified form. Here, we describe a protocol that uses dual affinity tag purification to selectively purify soluble recombinant Tau protein from bacteria that is functionally active for downstream applications including immunization, microtubule binding assays, and protein-protein interaction studies. [摘要]  微管相关蛋白Tau(由 MAPT 基因编码)的功能障碍已经涉及20多种神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病。 因此,Tau的生理和疾病相关功能引起了研究界的极大兴趣。 妨碍对Tau功能的研究和产生靶向Tau的药理学试剂的一个障碍是难以获得纯化形式的可溶性Tau蛋白。 在这里,我们描述了一种方案,该方案使用双亲和标签纯化从细菌中选择性纯化可溶性重组Tau蛋白,所述细菌对于下游应用具有功能活性,包括免疫,微管结合测定和蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。
【背景】Tau传统上被定义为微管结合蛋白;然而,在人类疾病中,Tau可以与轴突微管分离并错误定位到其他神经元区室,包括体细胞,树突和突触,其中与非微管蛋白和结构的相互作用驱动神经元功能障碍(Iqbal et al。 ,2016; Wang和Mandelkow,2016; Zhou et al。,2017; McInnes et al。,2018)。尽管神经原纤维缠结形式的Tau聚集体通常存在于死后患病的脑组织中,但研究表明,可溶性Tau,而不是聚集的Tau,是神经元功能障碍的主要原因(Crimins et al。,2012 ; Polydoro et al。,2014; Koss et al。,2016)。因此,研究Tau在疾病中的可溶性功能,例如鉴定蛋白质 - ...

α-Synuclein Aggregation Monitored by Thioflavin T Fluorescence Assay
Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract]  Studying the aggregation of amyloid proteins like α-synuclein in vitro is a convenient and popular tool to gain kinetic insights into aggregation as well as to study factors (e.g., aggregation inhibitors) that influence it. These aggregation assays typically make use of the fluorescence dye Thioflavin T as a sensitive fluorescence reporter of amyloid fibril formation and are conducted in a plate-reader-based format, permitting the simultaneous screening of multiple samples and conditions. However, aggregation assays are generally prone to poor reproducibility due to the stochastic nature of fibril nucleation and the multiplicity of modulating factors. Here we present a simple and reproducible protocol to study the aggregation of α-synuclein in a plate-reader based assay. [摘要]  研究淀粉样蛋白如α-突触核蛋白体外聚集是一种方便和流行的工具,可以获得聚集的动力学见解以及研究因子(例如,聚集抑制剂) 影响它。 这些聚集测定通常利用荧光染料硫磺素T作为淀粉样蛋白原纤维形成的敏感荧光报告物,并且以基于读板器的形式进行,允许同时筛选多个样品和条件。 然而,由于原纤维成核的随机性质和调节因子的多样性,聚集测定通常倾向于较差的再现性。 在这里,我们提出了一个简单和可重复的协议,以研究基于读板器的测定中α-突触核蛋白的聚集。

【背景】内源性蛋白质与淀粉样原纤维的聚集是一种致病过程,与几种疾病相关,例如,神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)或帕金森病(PD)以及全身性疾病如AL淀粉样变性( Knowles et al。,2014)。通过基于硫磺素T荧光的聚集测定,可以在基于板读者的装置中在体外中概括该过程,从而允许根据各种影响因素研究淀粉样蛋白的聚集动力学。

硫磺素T(ThT)是一种荧光染料,最初用于组织学样本中的淀粉样蛋白原纤维染色,于1959年由Vassar和Culling(Vassar和Culling,1959),其在体外检测和定量淀粉样纤维的应用

目前,硫代黄素T的聚集测定主要在荧光板读数器中进行,其中例如,96条件可以同时测试。由于原纤维成核的随机性质和影响蛋白质聚集的多种因素,这些测定法具有较差的重现性。因此,已经采用了增加ThT测定的再现性的策略,例如在测量期间使用井板的轨道摇动以及向孔中添加玻璃珠以改善混合(Giehm和Otzen,2010)。 ...

Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract]  Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate (1.0 x 10-6 transformants/total cell number/g plasmid DNA). Here, a detailed description of the optimized protocol for competence induction is presented. [摘要]  在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后,天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中,我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX,其导致最佳转化率(1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA)。 在此,提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。

【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程,之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态(Seitz和Blokesch,2013; Blokesch,2016)。群体感应系统,如 comCDE 或 comRS ,控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活(Håvarstein et al。,1995; Pestova et al。,1996; Kleerebezem et al。,1997b; Fontaine et al。,2015)。更具体地说, comC 和 comS 编码信息素,而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器(Håvarstein et al。,1995; ...

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