| Superresolution Microscopy of Drosophila Indirect Flight Muscle Sarcomeres
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Sarcomeres are extremely highly ordered macromolecular assemblies where proper structural organization is an absolute prerequisite to the functionality of these contractile units. Despite the wealth of information collected, the exact spatial arrangement of many of the H-zone and Z-disk proteins remained unknown. Recently, we developed a powerful nanoscopic approach to localize the sarcomeric protein components with a resolution well below the diffraction limit. The ease of sample preparation and the near crystalline structure of the Drosophila flight muscle sarcomeres make them ideally suitable for single molecule localization microscopy and structure averaging. Our approach allowed us to determine the position of dozens of H-zone and Z-disk proteins with a quasi-molecular, ...
[摘要] [摘要] 肉瘤是高度有序的大分子组装体，其中适当的结构组织是这些可收缩单位功能的绝对前提。尽管收集到大量信息，但许多H区和Z盘蛋白的确切空间排列最近未知的是，我们开发了一种强大的纳米方法来定位肌氨酸蛋白成分，其分辨率远低于衍射极限。样品制备的简便性和果蝇的近晶体结构 飞行肌肉瘤使其非常适合单分子定位显微镜检查和结构平均。我们的方法使我们能够以大约5-10 nm的准分子定位精度确定数十个H区和Z盘蛋白的位置。下文所述的协议为制备用于dSTORM成像的单个肌原纤维提供了一种简便且可重现的方法，此外还包括对定制的免费提供的软件工具箱的深入描述，以处理和定量分析原始定位数据。
[背景 ] 肉瘤的结构已通过X射线晶体学以及各种EM方法进行了详细研究，从而形成了来自许多物种的细丝和粗丝的准原子模型。尽管如此，这些检查取得了很好的结果对于肌动蛋白-肌球蛋白重叠区的了解，I带和H区复合物的空间排列仍是未知之数。荧光超分辨率显微镜（也称为纳米显微镜）的最新进展提供了远低于衍射极限的空间分辨率。值得注意的是，单分子定位显微镜（SMLM）可以非常高精度地提供多蛋白复合物的定位图，实际上达到了单个蛋白的大小分辨率（Sigal et al。，2018）。
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| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC is an ideal method to study protein-protein interactions in myofibrils. Here we present a protocol for generating transgenic flies compatible with BiFC and a method for analyzing protein-protein ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| Ex vivo Follicle Rupture and in situ Zymography in Drosophila
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Ovulation, the process of releasing a mature oocyte from the ovary, is crucial for animal reproduction. In order for the process of ovulation to occur, a follicle must be fully matured and signaled to rupture from the ovary. During follicle rupture in both mammals and Drosophila, somatic follicle cells are enzymatically degraded to allow the oocyte to be liberated from the follicle. Here, we describe a detailed protocol of our newly developed ex vivo follicle rupture assay in Drosophila, which represents a first assay allowing direct quantification of follicles’ capacity to respond to ovulation stimuli and rupture. This assay can be modified to stimulate rupture with other reagents (for example, ionomycin) or to query enzymatic activity (in situ ...
[摘要] 排卵是从卵巢释放成熟卵母细胞的过程，对动物繁殖至关重要。 为了发生排卵过程，卵泡必须完全成熟并发信号通知卵巢破裂。 在哺乳动物和果蝇卵泡破裂期间，体细胞卵泡细胞被酶促降解以允许卵母细胞从卵泡释放。 在此，我们描述了我们在果蝇中新开发的离体卵泡破裂测定的详细方案，其代表允许直接量化卵泡响应排卵刺激的能力的第一测定 并破裂。 可以修改该测定以刺激用其他试剂（例如离子霉素）破裂或查询酶活性（原位酶谱法）。 此外，这种检测方法允许基因或药理学筛选鉴定果蝇中调节卵泡破裂的基因或小分子。
【背景】由于在直接显示和定量排卵事件方面的技术挑战，对果蝇中的排卵的研究在很大程度上受到限制。在过去的几十年中，多种间接方法已经有了局限性。研究果蝇排卵的第一种方法是推动女性的腹部，并记录是否有卵子从产卵器排出（Aigaki et al。，1991; Lee <等人，2003）。这种方法是粗略估计子宫内是否有排卵的卵子。第二种常见的测定方法是测量雌蝇交配后的产蛋能力。产卵过程复杂，涉及卵泡的发育和成熟，排卵，排卵通过输卵管的运输，选择合适的产卵基质和产卵（spradling，1993; bloch="" qazi等人。，2003）。如果这些过程中的任何一个受到损害，则会导致产蛋率有缺陷。排卵受损的另一个指标是卵子保留表型（monastirioti等人，1996;="" monastirioti，2003;="" cole等人，2005）。如果女性卵巢内有过多的成熟卵泡，则表示无排卵表型。然而，这可以直接由排卵缺陷引起，或间接由产卵过程中排卵下游的缺陷引起。另一方面，缺乏保留表型并不一定意味着缺乏排卵缺陷。用于研究排卵的第四种测定方法是检查生殖道中是否存在卵子（heifetz="" et="" al。2000，lee="" et="" al。2009;="" lim="" 等人，，2014）。该测定法中的变化范围从量化排卵率的比例通过雌性在其下部输卵管/常见输卵管/子宫交配后的雌性百分比来定量（lee等人，2009;="" lim等人，="" ，2014年），以检查这些分开的区域随着时间的推移而分布的鸡蛋（heifetz="" et="" al。="" 2000="">）。然而，这些测定中的每一个都可能受卵子发生，排卵和产卵速度的影响。为了说明每个单独测定的所有可能的缺点，我们最近将雌性生殖道中的卵子保留测定，产蛋测定和卵子定位结合起来以估计卵子排卵的平均时间（排卵时间; Sun和Spradling，2013年; Deady et al。，2015年和2017年; Deady和Sun，2015年; ...
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