| Preparation of Yeast tRNA Sample for NMR Spectroscopy
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Transfer RNAs (tRNAs) are heavily decorated with post-transcriptional modifications during their biosynthesis. To fulfil their functions within cells, tRNAs undergo a tightly controlled biogenesis process leading to the formation of mature tRNAs. In addition, functions of tRNAs are often modulated by their modifications. Although the biological importance of post-transcriptional RNA modifications is widely appreciated, methods to directly detect their introduction during RNA biosynthesis are rare and do not easily provide information on the temporal nature of events. To obtain information on the tRNA maturation process, we have developed a methodology, using NMR as a tool to monitor tRNA maturation in a non-disruptive and continuous fashion in cellular extracts. By following the ...
[摘要] [摘要 ] 转移RNA（tRNA ）在其生物合成过程中大量修饰有转录后修饰。为了在细胞内履行其功能，tRNA 经历了严格控制的生物生成过程，导致了成熟的tRNA 的形成。此外，tRNA的功能通常是虽然转录后修饰RNA的生物学重要性被广泛理解，方法直接检测它们的RNA生物合成过程中引入是罕见的，并且不容易提供上events.To的时间特性信息获取的信息的tRNA 成熟 在此过程中，我们开发了一种方法，使用NMR作为监测细胞提取物中tRNA 成熟的无中断和连续方式。通过模型酵母tRNA 的时间分辨NMR 成熟，我们发现修饰是该方法的实施需要对具有不同修饰状态的tRNA 样品进行NMR光谱学分析，以鉴定各个修饰的NMR特征。此处将介绍用于NMR光谱分析修饰途径的tRNA 样品的生产，并在酵母tRNA Phe 上进行例证，但可以通过更改构建体的序列扩展到其他tRNA 。该方案描述了未修饰的生产通过体外转录获得tRNA 样品，并通过在大肠杆菌中重组表达tRNA 产生修饰的tRNA 样品。大肠杆菌。
[背景 ] 在生活的各个领域，合成和RNA的成熟包括在特定地点的核苷酸的转录后的化学修饰。在不同的RNA家族，tRNA基因不仅显示最高多种化学修饰，而且密度最高每转录修饰（〜中经修饰的核苷酸8-25％的tRNA 各种生物体的）（Boccaletto ...
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| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed instructions for the purification of the protein by immobilized metal affinity chromatography and the characterization of the protein in terms of purity, biotinylation, spectral photoswitching and the ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
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