| Root Gall Formation, Resting Spore Isolation and High Molecular Weight DNA Extraction of Plasmodiophora brassicae
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Isolation of DNA from obligate biotrophic soil-borne plant pathogens is challenging. This is because of their strict requirement of living plant tissue for their growth and propagation. A soil habitat further imposes risk of contamination from other microorganisms living in close vicinity of the plant roots. Here we present a protocol on how to prepare DNA suitable for advanced molecular analysis on the soil-borne pathogen Plasmodiophora brassicae, a peculiar unicellular plant pathogenic organism, causing disease on Crucifers. First, it is important to grow Brassica or Arabidopsis plants in infested soils below a temperature of 25 °C under moist conditions to promote root gall formation. Root galls should be harvested ahead of initiation of the decomposing ...
[摘要] 从专性营养型土壤植物病原体中分离DNA是具有挑战性的。这是因为他们对植物生长和繁殖的严格要求。土壤栖息地进一步增加了居住在植物根部附近的其他微生物污染的风险。在这里，我们提出了一个关于如何制备适用于土传病原体Plasmodiophora brassicae ，一种特殊的单细胞植物致病生物，导致十字花科病的DNA进行DNA分析的方案。首先，在潮湿条件下，在温度低于25°C的条件下，在感染的土壤中种植芸薹属植物或拟南芥属植物对于促进根gall形成是重要的。在分解过程开始之前，不应迟于接种拟南芥或芜菁植株后四或九周，收获根gall。数量减少的土壤生物的休息孢子通过匀浆gall组织的梯度离心获得。用70％酒精和一套不同的抗生素治疗可促进 P。芸苔纯度。基于CTAB的程序允许分离适合大规模平行测序分析的高质量DNA。
【背景】Plasmodiophora brassicae 是一种土壤传播的植物病原体，其在包括拟南芥属的十字花科家族中引起根虫（棒状杆菌）。根肿病对全世界油菜（油菜）和卷心菜的种植有重大影响。 P上。 brassicae 是指定给超级组Rhizaria的一种专性生物营养素（需要一种生长寄主），Rhizaria是研究最少的真核生物组之一（Sierra等人，2016; Sibbald和Archibald， 2017年）。系统发育上， ...
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| Nab Escaping AAV Mutants Isolated from Mouse Muscles
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Neutralizing antibodies (Nabs) are a major challenge in clinical trials of adeno-associated virus (AAV) vector gene therapy, because Nabs are able to inhibit AAV transduction in patients. We have successfully isolated several novel Nab-escaped AAV chimeric capsids in mice by administrating a mixture of AAV shuffled library and patient serum. These AAV chimeric capsid mutants enhanced Nab evasion from patient serum with a high muscle transduction efficacy. In this protocol, we describe the procedures for selection of the Nab-escaped AAV chimeric capsid, including isolation and characterization of Nab-escaping AAV mutants in mice muscle.
[摘要] 中和抗体（Nabs）是腺相关病毒（AAV）载体基因治疗的临床试验中的主要挑战，因为Nab能够抑制患者中的AAV转导。 我们已经成功地分离了几种新型Nab逃逸的AAV嵌合衣壳，通过给予AAV混洗库和患者血清的混合物。 这些AAV嵌合衣壳突变体增强了来自患有高肌肉转导功效的患者血清的Nab逃避。 在该协议中，我们描述了选择Nab逃逸的AAV嵌合衣壳的程序，包括在小鼠肌肉中分离和鉴定Nab逃逸的AAV突变体。
【背景】腺相关病毒（AAV）载体已被用于许多临床前研究和临床试验。使用AAV基因疗法已经接受了许多疾病的最终治疗。然而，在未来的临床试验中，循环中的中和抗体的存在对AAV载体的应用提出了主要挑战。已经探索过许多方法来逃避Nab的活动。在此，我们描述了从AAV改组库中选择Nab逃逸突变体的定向进化方法。
DNA改组是产生不同突变体的强大策略。通过连续几轮的表型选择，DNA改组文库的特点是质量更高，目标多样化。来自AAV改组文库的衣壳突变体的高通量选择已被用作探索具有靶向特定组织和逃避Nabs的能力的AAV突变体的有前途的策略。然而，大多数这些选择方法只是在体外测试;一些研究甚至使用了兔抗AAV2血清或人静脉注射免疫球蛋白。体内选择衣壳突变体的方法可以提供产生更有效的AAV突变体的平台，所述AAV突变体不仅从患者血清中逃脱Nab，而且增强特定组织中的转导。 ...
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