| Assessing Gαq/15-signaling with IP-One: Single Plate Transfection and Assay Protocol for Cell-Based High-Throughput Assay
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Cell-based functional assays are an important part of compound screening and drug lead optimization, and they can also play a crucial role in the determination of the residues involved in ligand binding and signaling for a particular G-protein-coupled receptor. Conventional methods used for Gαq/15-coupled receptors rely on the use of fluorescent probes for Ca++ sensing (such as Fura-2 and Fluo-4) or on the incorporation of [3H]-inositol into inositol 1,4,5- triphosphate (IP3). However, these methods are not suitable for screening large libraries of compounds or for screening several mutants of the same receptor. In contrast, the IP-One assay by Cisbio is a TR-FRET assay suitable for large compound library screening when using stable cell lines that express ...
[摘要] [摘要 ] 基于细胞的功能测定法是化合物筛选和药物先导物优化的重要组成部分，并且它们可以也参与配体结合和信令残留量的测定起到至关重要的作用为一个特定的G蛋白偶联受体。用于Gα常规方法的q / 15 -偶联受体依赖于使用用于钙荧光探针++ 感测（如的Fura-2和的Fluo-4）或上掺入[的3 H] - 肌醇成肌醇1,4- ，5-三磷酸（IP3）。然而，这些方法不适合用于筛选大文库的化合物或用于筛选相同的受体的几个突变体。相反，IP-一个测定由Cisbio公司是TR-FRET测定适合大型化合物文库使用的稳定细胞株的筛选时，表达一个特定7TMR 。但是，当使用瞬时转染的7TMR突变体时，此检测方法并不理想，因为它需要两步操作进行细胞培养。因此，我们已经优化了IP-One的测定使用协议的在384孔反向转染方法的板。这为先前用于筛选Gαq / 15 偶联7TMR 的几种突变体的两步法提供了一种省时和省资源的替代方案。
[背景 ] 七跨膜受体（7TMR），也被称为G蛋白偶联受体，是超家族参与信号转导的最重要的跨膜蛋白。它们是临床批准药物的30％至50％的目标（Overington 等，2006）。Gαq / 15 偶联的7TMR激活磷脂酶Cβ（PLCβ），并产生D-肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3触发细胞内Ca ++ ...
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| Protocol for Peptide Synthesis on Spectrally Encoded Beads for MRBLE-pep Assays
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Every living cell relies on signal transduction pathways comprised of protein-protein interactions (PPIs). In many cases, these PPIs are between a folded protein domain and a short linear motif (SLiM) within an unstructured region of a protein. As a result of this small interaction interface (3-10 amino acids), the affinities of SLiM-mediated interactions are typically weak (Kds of ~1-10 µM), allowing physiologically relevant changes in cellular concentrations of either protein partner to dictate changes in occupancy and thereby transmit cellular signals. However, these weak affinities also render detection and quantitative measurement of these interactions challenging and labor intensive. To address this, we recently developed MRBLE-pep, a technology that employs ...
[摘要] [摘要] 每个活细胞都依赖于由蛋白-蛋白相互作用（PPI）组成的信号转导途径。在许多情况下，这些PPI位于蛋白质非结构化区域内的折叠蛋白质结构域和短线性基序（SLiM ）之间。由于这种小交互界面（3-10个氨基酸）的结果，的亲和力了SLiM 介导的相互作用通常是弱（ķ d 小号〜1-10μM的），允许在任一蛋白伴侣的细胞浓度至生理学相关的变化指示占用率的变化，从而传输蜂窝信号。然而，这些弱的亲和力也使得对这些相互作用的检测和定量测量具有挑战性并且劳动强度大。为了解决这个问题，我们最近开发了MRBLE-pep，该技术利用在光谱编码的水凝胶珠上合成的肽库，可以并行测量蛋白质和许多不同肽之间的多重亲和力。与传统方法相比，该方法显着减少了蛋白质和多肽的数量以及测量蛋白质-肽亲和力所需的时间。在这里，我们提供了详细的协议，描述了如何：（1）功能化带有游离胺基的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）MRBLE磁珠，（2）在功能化的MRBLE上合成肽库，（3）通过MALDI质量验证合成的肽序列光谱分析和量化MRBLE上肽覆盖的均匀性，（4）在多重蛋白结合测定中使用MRBLE结合的肽库，以及（5）分析结合数据以确定结合亲和力。我们预计，该协议对于其他希望在自己的实验室中使用MRBLE-pep的研究人员以及对固相肽合成和蛋白质-蛋白质结合测定法开发广泛感兴趣的研究人员而言，将证明是有用的。
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