| Detection and Quantification of African Swine Fever Virus in MA-104 Cells
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] Detection of live African swine fever virus (ASFV) has historically relied on the use of primary swine macrophages (PSM). PSM do not replicate and have to be isolated fresh from donor swine. We previously identified that a MA-104 cells (ATCC #CRL-2378.1), a commercially available cell line isolated from African green monkey (Cercopithecus aethiops) kidney epithelial cells, supports the detection of ASFV from field samples with a sensitivity comparable to that of primary swine macrophages. Collection of swine blood or lungs is time costing, which is often not readily available in most veterinary diagnostic laboratories. MA-104 cells could thus be used as substitute for primary swine macrophages to save significant lead time by avoiding the production of primary swine macrophages. ...
[摘要] [摘要]活的非洲猪瘟病毒（ASFV）的检测在历史上一直依赖于原代猪巨噬细胞（PSM）的使用。PSM不能复制，必须从供体猪中新鲜分离。我们先前发现，MA-104细胞（ATCC＃CRL-2378.1）是一种从非洲绿猴（Cercopithecus aethiops ）肾上皮细胞分离的商业细胞系，支持从野外样品中检测ASFV，其灵敏度可与ASFV媲美。原发性猪巨噬细胞。Ç的猪的血液或肺ollection是时间成本计算，这往往是在大多数兽医诊断实验室容易获得的。MA-104细胞因此可以用作原代猪巨噬细胞的替代品，通过避免原代猪巨噬细胞的产生来节省大量的准备时间。
[背景]非洲猪瘟病毒（ASFV）的成员，非洲猪瘟病毒科的家庭，导致野猪和家猪具有高度传染性和致命性出血热，即非洲猪瘟（ASF）。成熟的病毒颗粒（病毒粒子）直径为175-215 nm，脂质双层包裹了二十面体衣壳和180-190千碱基对的双链DNA基因组。根据宿主特征和病毒株，该病毒会引起多种症状，包括高度致死性至亚临床性（Tulman等，2009 ...
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| Expression and Purification of Functionally Active Serotonin 5-HT2A Receptor in Insect Cells Using Low-titer Viral Stock
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The serotonin 5-HT2A receptor (5-HT2AR) is a member of the GPCR family that is important for various neurological functions and whose dysregulation causes many mental health disorders. Structural investigations of 5-HT2AR require the production of functionally active receptors expressed from eukaryotic cell cultures. In this protocol, we describe a step-by-step method to express and purify serotonin 5-HT2AR using a baculoviral expression vector system in Sf9 cell cultures, derived from our work with the rat (matching Uniprot ID P14842) and human (matching Uniprot ID P28223) 5-HT2ARs. A unique feature of this method is the utilization of cell culture additives to infect cells at low multiplicity of infection, thereby using several fold ...
[摘要] [摘要] 血清素5-HT2A受体（5-HT2AR）是GPCR家族的一员，对多种神经功能起重要作用，其调节失调会导致许多心理健康障碍。5-HT2AR的结构研究需要从真核细胞培养物中产生功能活性受体。在本方案中，我们描述了一种在Sf9细胞培养中使用杆状病毒表达载体系统表达和纯化血清素5-HT2AR的分步方法，该方法来源于我们对大鼠（匹配Uniprot ID P14842）和人类（匹配Uniprot ID P28223）5-HT2AR的研究。这种方法的一个独特的特点是使用细胞培养添加剂以低感染倍数感染细胞，从而使用比不使用添加剂的先前方法少几倍的病毒滴度。该方案可以通过改变感染后收获时间来选择性地过度表达糖基化或非糖基化形式的受体。
[背景]在过去十年中，由于功能活性受体高产表达方法的发展，对GPCRs的结构研究激增（Granier和Kobilka，2012）。其中，5-羟色胺GPCRs是一组小而多样的受体，在神经调节中起着重要作用，它们的功能障碍与许多心理健康障碍有关（Berger等人，2009）。在利用真核宿主进行蛋白质表达的多种方法中，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，利用Sf9细胞结合杆状病毒表达系统表达GPCRs因其高产率和可靠性而成为一个突出的方法（Saarenpaa等人，2015年；Wiseman等人，2020年）。然而，各种方法不断发展，以克服现有方法的各种缺点。目前还没有一种统一的、单一的方法来表达所有类型的GPCRs，并没有足够高的产率来进行结构研究。这在一定程度上是由于这些受体的多样性，以及它们的序列需要修改，以使晶体学研究成为可能。单电子显微镜的出现对电子显微镜的研究提出了更高的要求。利用昆虫细胞中杆状病毒表达的现有方法的一个关键要求是获得高滴度的病毒储备，这在许多情况下是非常重要的。此外，对于蛋白质的生产，感染细胞通常在感染的多样性~1-5，需要使用大量的病毒滴度，而病毒滴度会随着时间的推移而耗尽。使用多个批次的病毒滴度可以增加批次间的变异性。因此，强烈需要消耗更少病毒滴度的方法。此外，许多GPCRs的天然形式，包括5-羟色胺受体，具有广泛的糖基化，这不是所有情况下都需要的。因此，任何能够提供主要糖基化或非糖基化形式受体的方法，优选地通过简单改变方案，也是可取的。在这里，我们描述了一种在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达和纯化5-HT2AR的方法，与现有方法相比，该方法需要最少的病毒滴度，并且可以通过改变感染后收获时间来选择糖基化程度。该方案基于先前的工作（Wacker等人，2013；Mahesh等人，2018；Mozumder等人，2020），已经标准化，以制备用于高分辨率低温组织结构测定的样品，并且适用于采用类似表达和纯化策略的其他GPCR、膜蛋白和其他可溶性蛋白质。 ...
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| Barley Transformation by Particle Bombardment Using Callus
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] The delivery of desired construct into plant cells relies mainly on Agrobacterium-mediated transformation. However, Agrobacterium transformation is still very challenging for barley as only one genotype is amendable to Agrobacterium infection. The demand for developing genotype independent transformation methods is thus high. Here we report a transformation protocol for barley cultivar “Rika” by particle bombardment.
[摘要] [摘要 ] 所需构建体向植物细胞的传递主要依靠农杆菌介导的转化。然而，大麦农杆菌转化仍然具有很大的挑战性，因为只有一种基因型可以改变农杆菌感染，因此对基因型独立转化方法的开发提出了很高的要求。在这里，我们报告了通过粒子轰击对大麦品种“ Rika”的转化方案。
[背景 ] 基于组织培养农杆菌转化通常用于导入的载体DNA导入植物细胞，但它往往是基因型的高效转化方案的dependent.The可用性因此是用于基因组编辑的经由成功至关重要农杆菌transformation.Barley是的一个不幸的是，在经济上很重要的谷物作物上，农杆菌转化原则上仅适用于“金承诺”品种，因此需要开发替代转化方法以通过作物基因组编辑促进遗传改良。 ，这可能是大麦的另一种转化方法。在这里，我们报道了使用愈伤组织根据小麦粒子轰击对大麦转化进行粒子轰击的方案（Tian 等人，2019）。
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