| Generation and Implementation of Reporter BHK-21 Cells for Live Imaging of Flavivirus Infection
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] The genus Flavivirus within the family Flaviviridae includes many viral species of medical importance, such as yellow fever virus (YFV), Zika virus (ZIKV), and dengue virus (DENV), among others. Presently, the identification of flavivirus-infected cells is based on either the immunolabeling of viral proteins, the application of recombinant reporter replicons and viral genomes, or the use of cell-based molecular reporters of the flaviviral protease NS2B-NS3 activity. Among the latter, our flavivirus-activatable GFP and mNeptune reporters contain a quenching peptide (QP) joined to the fluorescent protein by a linker consisting of a cleavage site for the flavivirus NS2B-NS3 proteases (AAQRRGRIG). When the viral protease cleaves the linker, the quenching peptide is removed, and the ...
[摘要] [摘要]本属黄病毒家族中的黄病毒包括医学重要性许多病毒种类，如黄热病病毒（YFV），寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV），等等。目前，黄病毒感染细胞的鉴定是基于病毒蛋白的免疫标记，重组报告子复制子和病毒基因组的应用，或黄病毒蛋白酶NS2B-NS3活性的基于细胞的分子报告子的使用。在后者中，我们的黄病毒可激活的GFP和mNeptune报道分子含有通过接头连接到荧光蛋白的淬灭肽（QP），该接头由黄病毒NS2B - NS3蛋白酶（AAQRRGRIG）的切割位点组成。当病毒蛋白酶切割接头时，淬灭肽被去除，并且荧光蛋白采用促进荧光的构象。在这里，我们提供了用于表达，选择和实施表达黄病毒基因编码分子报告子的稳定BHK-21细胞的详细协议，适用于通过活细胞成像监测病毒感染。我们还将描述图像分析过程并提供所需的软件管道。我们的报告细胞允许通过活细胞成像对黄病毒的参考菌株和天然菌株实施单细胞感染动力学以及噬菌斑测定。
图形摘要：
黄病毒感染实时成像的报告基因BHK-21细胞的产生与实施工作流。
[背景]黄病毒代表了正在引起并正在重新出现的全球性威胁，可能引起动物和人类疾病，包括许多与医学有关的病毒，例如黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），日本脑炎病毒（JEV），登革热病毒（DENV），并兹卡六RUS（ZIKV），等等（摹·乌尔德·所罗门，2008） ...
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| Identification of Intrinsic RNA Binding Specificity of Purified Proteins by in vitro RNA Immunoprecipitation (vitRIP)
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] RNA-protein interactions are often mediated by dedicated canonical RNA binding domains. However, interactions through non-canonical domains with unknown specificity are increasingly observed, raising the question how RNA targets are recognized. Knowledge of the intrinsic RNA binding specificity contributes to the understanding of target selectivity and function of an individual protein.
The presented in vitro RNA immunoprecipitation assay (vitRIP) uncovers intrinsic RNA binding specificities of isolated proteins using the total cellular RNA pool as a library. Total RNA extracted from cells or tissues is incubated with purified recombinant proteins, RNA-protein complexes are immunoprecipitated and bound transcripts are identified by deep sequencing or quantitative RT-PCR. ...
[摘要] [摘要] RNA-蛋白质相互作用通常由专门的规范RNA结合域介导。然而，越来越多地观察到通过具有未知特异性的非经典结构域的相互作用，这提出了如何识别RNA靶标的问题。内在的RNA结合特异性的知识有助于理解单个蛋白质的靶标选择性和功能。
所呈现的体外RNA免疫沉淀测定法（vitRIP ）揭示固有RNA使用总细胞RNA池作为分离的蛋白质的结合特异性一个库。从细胞或组织中提取的总RNA与纯化的重组蛋白孵育，免疫沉淀RNA-蛋白复合物，并通过深度测序或定量RT-PCR鉴定结合的转录物。这些RNA中丰富的RNA类和核苷酸频率决定了重组蛋白的固有特异性。该简单而通用的方案可适用于任何细胞类型或组织的其他RNA结合蛋白和总RNA文库。
图形摘要：
图1.体外RNA免疫沉淀（vitRIP ）方案示意图
[背景]真核细胞包含许多不同的RNA类，具有成千上万的RNA种类以及与之相互作用的高度多样化的蛋白质。根据结合的RNA序列或结构的定义以及相互作用中涉及的蛋白质结构域的不同，RNA-蛋白质相互作用可分为特异性和非特异性（Jankowsky和Harris，2015）。越来越多地观察到通过未知特异性的非经典RNA结合结构域进行的RNA相互作用，这提出了如何识别专用RNA靶标的问题。 ...
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| Rapid Genome Engineering of Pseudomonas Assisted by Fluorescent Markers and Tractable Curing of Plasmids
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Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] Precise genome engineering has become a commonplace technique for metabolic engineering. Also, insertion, deletion and alteration of genes and other functional DNA sequences are essential for understanding and engineering cells. Several techniques have been developed to this end (e.g., CRISPR/Cas-assisted methods, homologous recombination, or λ Red recombineering), yet most of them rely on the use of auxiliary plasmids, which have to be cured after the editing procedure. Temperature-sensitive replicons, counter-selectable markers or repeated passaging of plasmid-bearing cells have been traditionally employed to circumvent this hurdle. While these protocols work reasonably well in some bacteria, they are not applicable for other species or are time consuming and laborious. Here, we present ...
[摘要] [摘要]精确的基因组工程已成为代谢工程的一种普遍技术。同样，基因和其他功能性DNA序列的插入，缺失和改变对于理解和改造细胞也是必不可少的。几种技术已经发展到该端部（例如，CRISPR / CAS-辅助方法，同源重组，或 λ 红色重组），但其中大多数依赖于辅助质粒的使用，必须在编辑程序后将其固化。传统上已采用对温度敏感的复制子，反向选择标记或带有质粒的细胞的重复传代来规避这一障碍。尽管这些协议在某些细菌中可以很好地发挥作用，但它们不适用于其他物种，或者既费时又费力。在这里，我们提出了快速和通用的荧光假单胞菌荧光标记辅助基因组编辑协议，然后通过用户控制的质粒复制干净固化辅助质粒。一种荧光标记有助于鉴定基因组编辑的菌落，而第二种报道分子能够检测无质粒的细菌克隆。该协议不仅是用于假单胞菌物种的最快方法，而且可以轻松地适应任何类型的基因组修饰，包括序列删除，插入和替换。
图形概要：
带有可治愈质粒的假单胞菌的快速基因组工程
[背景]靶向，精确的基因组操纵技术已经大大推进了微生物工程领域。这样的方法不仅允许评估基因型与表型的关系，而且使微生物细胞工厂的复杂工程化成为可能。近年来，CRISPR / Cas9方法为真核生物的精确基因组工程铺平了道路。在细菌中，CRISPR / ...
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