| Isolation and Culture of Mouse Lung ILC2s
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Group 2 Innate Lymphoid Cells (ILC2) play an important role in immune responses at barrier surfaces, notably in the lung during airway allergic inflammation or asthma. Several studies have described methods to isolate ILC2s from wild-type naive mice, most of them using cell sorting to obtain a pure population. Here, we describe in detail, a simple, efficient method for isolation and culture of lung mouse ILC2s. Lungs from Rag2-/- mice pretreated with IL-33 are collected and processed into single cell suspensions. Lymphoid cells are then recovered by density gradient separation. Lin-CD45+ cells are selected by depletion of lineage positive cells followed by positive selection of CD45+ cells. Culture of the isolated cells for several days ...
[摘要] 第2组先天性淋巴细胞（ILC2）在屏障表面，特别是在气道过敏性炎症或哮喘期间的肺中的免疫应答中起重要作用。一些研究已经描述了从野生型幼稚小鼠中分离ILC2的方法，其中大多数使用细胞分选来获得纯种群。在这里，我们详细描述了一种简单有效的肺小鼠ILC2分离和培养方法。收集用IL-33预处理的 Rag2 - / - 小鼠的肺并加工成单细胞悬浮液。然后通过密度梯度分离回收淋巴样细胞。通过耗尽谱系阳性细胞然后阳性选择CD45 + 细胞来选择Lin - CD45 + 细胞。将分离的细胞培养数天导致高度纯化的ILC2群体表达典型的细胞表面标志物（CD90.2，Sca1，CD25，CD127和IL-33R）。这些细胞可在培养物中扩增长达10天，并用于多种离体测定或体内过继转移实验。
【背景】第2组先天性淋巴细胞（ILC2）是组织驻留细胞，其在抗寄生虫先天免疫以及过敏性炎症的发展中起关键作用。它们通过产生大量的2型细胞因子IL-5和IL-13对上皮细胞衍生的细胞因子如白细胞介素-33（IL-33）起反应，后者又诱导嗜酸性粒细胞增多和粘液产生（Cayrol和Girard，2018）。为了更好地表征这些细胞的功能和调节，许多组通过荧光激活细胞分选（FACS）从野生型小鼠（WT）的肺中分选ILC2。由于稳定状态下肺中存在的ILC2数量较少，因此该方法导致纯化细胞的产量较低（每只小鼠1×10 ...
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| Using Stable Isotopes in Bone Marrow Derived Macrophage to Analyze Metabolism
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Using gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) to analyze the citric acid cycle (CAC) and related intermediates (such as glutamate, glutamine, GABA, and aspartate) is an analytical approach to identify unexpected correlations between apparently related and unrelated pathways of energy metabolism. Intermediates can be as expressed as their absolute concentrations or relative ratios by using known amounts of added reference standards to the sample. GC-MS can also distinguish between heavy labeled molecules (2H- or 13C-labeled) and the naturally occurring most abundant molecules. Applications using tracers can also assess the turnover of specific metabolic pools under various physiological and pathological conditions as well as for pathway discovery.
The ...
[摘要] 使用气相色谱质谱（GC-MS）分析柠檬酸循环（CAC）和相关中间体（如谷氨酸，谷氨酰胺，GABA和天冬氨酸）是一种分析方法，用于识别明显相关和不相关的能量途径之间的意外相关性代谢。通过使用已知量的样品添加的参考标准，中间体可以表示为它们的绝对浓度或相对比例。 GC-MS还可以区分重标记分子（ 2 H-或 13 C-标记的）和天然存在的最丰富的分子。使用示踪剂的应用还可以评估在各种生理和病理条件下以及用于途径发现的特定代谢池的周转。
以下方案是一种相对简单的方法，不仅对小浓度的代谢中间体敏感，而且还可以 in vivo 或 in vitro 用于确定各种新陈代谢的完整性途径，如特定代谢物池内的通量变化。我们使用该协议来确定磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1 （ Pck1 ）基因在小鼠巨噬细胞中的作用，以确定 13 C将葡萄糖标记为特定的CAC代谢物库
【背景】随着细胞和小鼠中基因表达改变的发展，需要了解这些缺失或过表达的基因如何影响代谢途径的调节。在该方案中，我们使用稳定同位素来确定进入CAC的葡萄糖通量如何改变葡萄糖对柠檬酸盐，琥珀酸盐和苹果酸盐的贡献。使用稳定同位素和目标分析代谢只是在细胞培养中使用稳定同位素的一个好处。
本方案中描述的用于细胞内代谢物功能定量的方法是通过在U- 13 ...
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| Isolation of Murine Brain and Lung Microvascular Endothelial Cells
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] This protocol describes how to isolate murine endothelial cells from newborn mice brain and 3-month-old mice lung by modifying the original protocols (Sobczak et al., 2010; Ruck et al., 2014). We have used the protocol to analyze mRNA expression level in brain endothelial cells (Sawaguchi et al., 2017). Isolated lung endothelial cells were expanded in vitro for various downstream experiments such as gene expression analysis and cell-based signaling assay.
[摘要] 该协议描述了如何通过修改原始方案从新生小鼠脑和3个月大的小鼠肺中分离鼠内皮细胞（Sobczak et al。，2010; Ruck et al。，2014）。 我们使用该方案分析脑内皮细胞中的mRNA表达水平（Sawaguchi et al。，2017）。 分离的肺内皮细胞在体外扩增用于各种下游实验，例如基因表达分析和基于细胞的信号传导测定。
【背景】 该方案描述了从小鼠脑和肺中分离鼠内皮细胞的实验程序。 我们使用新生小鼠使用抗CD31抗体分离脑内皮细胞。 使用该方案，可以从脑内皮细胞中分离出适合于基因表达分析的2μg总RNA，尽管不能完全消除周细胞和星形胶质细胞。 我们还使用3个月大的小鼠肺使用抗CD31和抗CD102抗体分离肺内皮细胞。 将分离的肺内皮细胞在体外6cm培养皿中扩增，并用于各种下游实验，例如基因表达分析和基于细胞的信号传导测定。
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