| Magnet-assisted Flow Cytometry of in vivo Tumors to Quantitate Cell-specific Responses to Magnetic Iron Oxide Nanoparticles
|
|
Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] A clear understanding of nanoparticle interactions with living systems at the cellular level is necessary for developing nanoparticle-based therapeutics. Magnetic iron oxide nanoparticles provide unique opportunities to study these interactions because of their responsiveness to magnetic fields. This enables sorting of cells containing nanoparticles from in vivo models. Once sorted, flow cytometry can identify individual cell types, which can be further analyzed for iron content, gene or protein expression changes associated with nanoparticle uptake, and for other biological responses at a molecular level. Here we provide a detailed protocol to sort and identify cells in the tumor microenvironment that have internalized magnetic iron oxide nanoparticles following intravenous ...
[摘要] [摘要] 在开发基于纳米颗粒的治疗方法时，必须对纳米颗粒与生物系统在细胞水平上的相互作用有一个清晰的了解。磁性氧化铁纳米颗粒因其对磁场的响应性而提供了研究这些相互作用的独特机会。这使得能够从体内模型中筛选出包含纳米颗粒的细胞。排序后，流式细胞仪可以识别单个细胞类型，然后可以进一步分析其铁含量，与纳米颗粒摄取相关的基因或蛋白质表达变化以及分子水平的其他生物学反应。在这里，我们提供了详细的协议，用于在静脉内给药后分类和鉴定肿瘤微环境中具有内在磁性氧化铁纳米颗粒的细胞。
[背景]几种基于纳米颗粒的抗癌药物已在临床上使用，因为它们已显示出对诊断，抗癌药物传递和热疗的安全性和有效性（Marchal等，2015 ；Wu等，2015）。然而，在我们对癌症纳米医学的理解上仍然存在重大差距，主要是因为纳米颗粒与免疫细胞之间相互作用的细节仍然未知。其他人和我们已经将纳米粒子免疫细胞的相互作用确定为影响体内纳米粒子命运和在肿瘤中保留的关键变量（Sheen等人，2014；Zanganeh等人，2016； ...
|
|
|
| Isolation of Microvascular Endothelial Cells
|
|
Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. Murine endothelial cell culture is an important tool for cardiovascular disease research. This protocol demonstrates a quick, efficient method for the isolation of microvascular endothelial cells from murine tissues without any special equipment. To isolate endothelial cells, the lung or heart were mechanically minced and enzymatically digested with collagenase and trypsin. The single cell suspension obtained was then incubated with an anti-CD31, anti-CD105 antibody and with biotinylated isolectin B-4. The endothelial cells were harvested using magnetic bead separation with rat anti-mouse Ig- and streptavidin-conjugated microbeads. Endothelial cells were ...
[摘要] 血管内皮是正常血管稳态所必需的。其功能障碍参与各种心血管疾病。小鼠内皮细胞培养是心血管疾病研究的重要工具。该协议演示了一种快速，有效的方法从小鼠组织中分离微血管内皮细胞而无需任何特殊设备。为了分离内皮细胞，将肺或心脏机械切碎并用胶原酶和胰蛋白酶进行酶促消化。然后将获得的单细胞悬浮液与抗CD31，抗CD105抗体和生物素化的异凝集素B-4温育。使用大鼠抗小鼠Ig-和链霉亲和素缀合的微珠，使用磁珠分离收获内皮细胞。扩张内皮细胞并收集用于随后的分析。这些培养物的形态和表型特征在培养10代以上保持稳定。在任何阶段没有过度生长的非内皮来源的污染细胞。
【背景】微血管内皮细胞通过调节白细胞再循环和作为T淋巴细胞的抗原呈递细胞而在免疫应答的发展中起中心作用。内皮的良好状态对血管稳态很重要。功能失调的内皮参与各种心血管疾病，包括动脉粥样硬化，血管炎和缺血/再灌注损伤（Cid et al。，2004; Wang等人，2007）。因此，体外培养的内皮细胞培养物是研究血管生理学和疾病病理学的重要工具。然而，分离原代鼠类内皮细胞被认为是特别困难的，因为大多数描述的方案涉及用消化酶灌注器官或大血管和耗时的纯化过程（Gumkowski等人，1987） 。
该协议的目的是提供一种简单的方法，不需要使用任何特殊设备即可从肺/心脏中分离和扩展内皮细胞。使用这种方法，我们以前补充了体内研究，证明了CD31信号传导在内皮细胞细胞保护中的重要性（Cheung等人，2015年）。 ...
|
|
|
| High Dimensional Functionomic Analysis of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at a Single Cell Level
|
|
Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ability to conduct investigation of cellular transcription, signaling, and function at the single-cell level has opened opportunities to examine heterogeneous populations at unprecedented resolutions. Although methods have been developed to evaluate high-dimensional transcriptomic and proteomic data (relating to cellular mRNA and protein), there has not been a method to evaluate corresponding high-dimensional functionomic data (relating to cellular functions) from single cells. Here, we present a protocol to quantitatively measure the differentiation potentials of single human hematopoietic stem and progenitor cells, and then cluster the cells according to these measurements. High dimensional functionomic analysis of cell potential allows cell function to be linked to molecular ...
[摘要] 在单细胞水平进行细胞转录，信号传导和功能调查的能力为以前所未有的决议研究异质人群开启了机会。 尽管已经开发了评估高维转录组学和蛋白质组学数据（与细胞mRNA和蛋白质有关）的方法，但尚未有方法从单个细胞评估相应的高维功能组学数据（与细胞功能有关）。 在这里，我们提出了一种方案来定量测量单个人造血干细胞和祖细胞的分化潜能，然后根据这些测量结果聚集细胞。 细胞电位的高维功能组分析允许细胞功能与相同祖细胞群体内的分子机制相关联。
【背景】单细胞水平的细胞转录，信号传导和功能单细胞测量技术的发展，以及流式细胞仪等先前存在的技术的发展，使得新镜头能够检测复杂的异质群体。这些方法产生大量数据，这可以借助于降维算法来解释，如使用Mpath，Monocole，PCA，Wishbone或扩散图算法在单细胞RNA-Seq上所示的（Paul等， 2016年;参见 et al。，2017），以及使用tSNE或PhenoGraph的CyTOF（Amir et al。，2013; Levine et al 。，2015）。
我们开发了这个协议，以允许在单细胞环境中对造血祖细胞的大规模培养物进行功能分析和随后的降维。在这个协议中，我们描述了在细胞因子的基质细胞培养物中培养人CD34 ...
|
|
|