| Tandem Tag Assay Optimized for Semi-automated in vivo Autophagic Activity Measurement in Arabidopsis thaliana roots
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Autophagy is the main catabolic process in eukaryotes and plays a key role in cell homeostasis. In vivo measurement of autophagic activity (flux) is a powerful tool for investigating the role of the pathway in organism development and stress responses. Here we describe a significant optimization of the tandem tag assay for detection of autophagic flux in planta in epidermal root cells of Arabidopsis thaliana seedlings. The tandem tag consists of TagRFP and mWasabi fluorescent proteins fused to ATG8a, and is expressed in wildtype or autophagy-deficient backgrounds to obtain reporter and control lines, respectively. Upon autophagy activation, the TagRFP-mWasabi-ATG8a fusion protein is incorporated into autophagosomes and delivered to the lytic vacuole. Ratiometric ...
[摘要] [摘要] 自噬是真核生物的主要分解代谢过程，在细胞稳态中起关键作用。体内自噬活性（通量）的测量是研究该途径在生物体发育和应激反应中的作用的有力工具。在这里，我们描述了串联标记测定的重大优化，用于检测拟南芥幼苗表皮根细胞中植物体内的自噬通量。串联标签由TagRFP 和mWasabi组成 荧光蛋白与ATG8a融合，并在野生型或自噬缺陷型背景中表达，分别获得报告基因和对照。自噬激活后，将TagRFP-mWasabi-ATG8a融合蛋白掺入自噬体中并递送至裂解液泡中。对照和报道细胞液泡中低pH耐受的TagRFP 和低pH敏感的mWasabi 荧光的比例定量可以可靠地估计自噬活性。我们为植物生长，成像和半自动数据分析提供了分步协议。该协议提出了一种快速而可靠的方法，该方法可用于需要植物自噬通量定量的任何研究。
[背景 ] 串联标记（TT）分析是定量酵母和哺乳动物细胞中自噬通量的广泛方法（Zhou 等，2012； Klionsky 等，2016； Yoshii和Mizushima，2017）。先前已经描述了适用于植物细胞中使用tobacc研究?BY-2细胞悬浮培养物小号（Hanamata 等人，2013; Klionsky 。等人，2016 ...
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| In planta Transcriptome Analysis of Pseudomonas syringae
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Profiling bacterial transcriptome in planta is challenging due to the low abundance of bacterial RNA in infected plant tissues. Here, we describe a protocol to profile transcriptome of a foliar bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, in the leaves of Arabidopsis thaliana at an early stage of infection using RNA sequencing (RNA-Seq). Bacterial cells are first physically isolated from infected leaves, followed by RNA extraction, plant rRNA depletion, cDNA library synthesis, and RNA-Seq. This protocol is likely applicable not only to the A. thaliana–P. syringae pathosystem but also to different plant-bacterial combinations.
[摘要] 由于受感染植物组织中细菌RNA的丰度低，因此在植物中分析细菌转录组具有挑战性。 在这里，我们描述了一个描述叶子细菌病原体转录组的协议， Pseudomonas syringae pv。 番茄 DC3000，在感染早期的拟南芥叶中使用RNA测序（RNA-Seq）。 首先从感染的叶子中物理分离细菌细胞，然后进行RNA提取，植物rRNA消耗，cDNA文库合成和RNA-Seq。 该协议不仅适用于 A.拟南芥-P。 syringae 病理系统，但也适用于不同的植物 - 细菌组合。
【背景】植物已经进化出先天免疫系统以抵御病原体攻击。在过去的几十年中，已经深入研究了病原体识别和免疫信号传导途径的分子机制。然而，植物免疫如何影响病原体代谢以抑制病原体生长几乎不被理解，因为在植物中分析病原体反应很困难。在细菌病原体的情况下，植物叶内的转录组分析很难研究，因为细菌mRNA的量远低于植物的数量;由于植物中细菌的人口密度低，在感染的早期阶段尤其具有挑战性。为克服这一局限性，我们建立了一种从感染的植物叶片中分离细菌并用RNA-Seq分析细菌转录组的方法。该方法已成功用于分析模型细菌病原体 Pseudomonas syringae pv的转录组。 番茄 DC3000在模式植物 Arabidopsis thaliana 中的各种条件下（Nobori et al。，2018）. ...
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| A Method to Injure, Dissect and Image Indirect Flight Muscle of Drosophila
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Inducing an injury specifically to Drosophila flight muscles is a difficult task, owing to the small size of the muscles and the presence of the cuticle. The protocol described below provides an easy and reproducible method to induce injury in the Drosophila flight muscles.
[摘要] 由于肌肉尺寸小和角质层的存在，特别针对果蝇飞行肌肉诱导损伤是一项艰巨的任务。 下面描述的方案提供了一种简单且可重复的方法来诱导果蝇飞行肌肉中的损伤。
【背景】脊椎动物的肌肉进行再生，这是一种归因于卫星细胞（即常驻干细胞）的过程。 我们的实验室最近表明，果蝇的肌肉具有与脊椎动物卫星细胞相似的干细胞，即昆虫卫星细胞，并显示对肌肉损伤的增殖反应（Chaturvedi等人，2017年））。 飞蝇遗传学的易用性和我们的诱导伤害的方法为解决再生生物学领域的相关问题提供了机会。 我们已经标准化了一种以更好的精确度损伤背侧纵肌（DLMs）纤维的方案，并且该方法可以用于研究损伤后肌肉中涉及的修复机制。
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