| Assessment of Diadenylate Cyclase and c-di-AMP-phosphodiesterase Activities Using Thin-layer and Ion Exchange Chromatography
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] All living cells use cyclic nucleotides as second messengers for signal sensing and transduction. Cyclic di-3′,5′-adenosine monophosphate (c-di-AMP) is primarily involved in the control of bacterial and euryarcheal osmoadaptation and is produced by diadenylate cyclases from two molecules of ATP. Specific phosphodiesterases hydrolyze c-di-AMP to the linear phosphoadenylate adenosine 5′-pApA or to AMP. Different methods including high-performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography (TLC) and ion exchange chromatography (IEX) can be used to determine activities of c-di-AMP-synthesizing and degrading enzymes. Here, we describe in detail the TLC and IEX methods adapted for characterization of the diadenylate cyclase DisA and the phosphodiesterase AtaC from ...
[摘要] [摘要]所有活细胞均使用环状核苷酸作为第二信使，以进行信号传感和转导。环状二-3 ' ，5 ' -腺苷一磷酸（C-二-AMP）主要涉及细菌和控制euryarcheal osmoadaptation并且由产生diadenylate环化酶从ATP的两个分子。特定的磷酸二酯酶将c-di-AMP水解为线性磷酸腺苷腺苷5'-pApA或AMP。可以使用包括高效液相色谱（HPLC），薄层色谱（TLC）和离子交换色谱（IEX）在内的各种方法来确定c-di-AMP合成和降解酶的活性。在这里，我们详细描述了TLC和IEX方法适合于表征diadenylate环化酶DISA和磷酸二酯酶ATAC从链霉菌venezuelae 。TLC可以快速，轻松地分离放射性标记的底物和产品，而IEX避免了潜在危险的放射性底物的利用，如果没有HPLC系统，则可以用作良好的替代品。与TLC分析不同，无法使用IEX分析并行分析样品，因此更加耗时。
[背景]环核苷酸第二信使是原核和真核信号通路中的关键分子。环状二-3 ' ，5 ' -腺苷一磷酸（三二- AMP）是一种细菌第二信使与许多重要的功能，如渗压剂动态平衡调节，细胞壁代谢，生物膜的形成，DNA完整，孢子形成，毒力和生长（Fahmi et ...
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| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed instructions for the purification of the protein by immobilized metal affinity chromatography and the characterization of the protein in terms of purity, biotinylation, spectral photoswitching and the ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
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