| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Measurement of Oxygen Consumption Rate (OCR) and Extracellular Acidification Rate (ECAR) in Culture Cells for Assessment of the Energy Metabolism
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Mammalian cells generate ATP by mitochondrial (oxidative phosphorylation) and non-mitochondrial (glycolysis) metabolism. Cancer cells are known to reprogram their metabolism using different strategies to meet energetic and anabolic needs (Koppenol et al., 2011; Zheng, 2012). Additionally, each cancer tissue has its own individual metabolic features. Mitochondria not only play a key role in energy metabolism but also in cell cycle regulation of cells. Therefore, mitochondria have emerged as a potential target for anticancer therapy since they are structurally and functionally different from their non-cancerous counterparts (D'Souza et al., 2011). We detail a protocol for measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) measurements ...
[摘要] 哺乳动物细胞通过线粒体（氧化磷酸化）和非线粒体（糖酵解）代谢产生ATP。已知癌细胞使用不同的策略重新编程它们的代谢以满足能量和合成代谢需要（Koppenol等人，2011; Zheng，2012）。此外，每个癌症组织都有其自己的个体代谢特征。线粒体不仅在能量代谢中起关键作用，而且在细胞的细胞周期调控中也起关键作用。因此，线粒体作为抗癌治疗的潜在靶标已经出现，因为它们在结构和功能上与其非癌对应物不同（D'Souza等人，2011）。我们详细介绍了利用海马XF24细胞外通量分析仪（图1）测量活细胞中氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）测量的方案。 Seahorse XF24细胞外通量分析仪持续测量细胞上清液中的氧浓度和质子流量（Wu等人，2007）。这些测量结果在OCR和ECAR值中转换，并能够直接定量线粒体呼吸和糖酵解。有了这个协议，我们试图评估三种不同癌细胞系的基线粒体功能和线粒体应激反应细胞毒性测试先导化合物甲磺卡西林，以研究其作用机制。将细胞铺在XF24细胞培养板中并保持24小时。在分析之前，将培养基替换为无缓冲的DMEM pH7.4，然后使细胞在非代谢通量分析前使用Seahorse XF在非CO 2孵育器中平衡以允许精确测量Milli-pH单位改变。 ...
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| Immunoprecipitation of Tri-methylated Capped RNA
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Cellular quiescence (also known as G0 arrest) is characterized by reduced DNA replication, increased autophagy, and increased expression of cyclin-dependent kinase p27Kip1. Quiescence is essential for wound healing, organ regeneration, and preventing neoplasia. Previous findings indicate that microRNAs (miRNAs) play an important role in regulating cellular quiescence. Our recent publication demonstrated the existence of an alternative miRNA biogenesis pathway in primary human foreskin fibroblast (HFF) cells during quiescence. Indeed, we have identified a group of pri-miRNAs (whose mature miRNAs were found induced during quiescence) modified with a 2,2,7-trimethylguanosine (TMG)-cap by the trimethylguanosine synthase 1 (TGS1) protein and transported to the cytoplasm ...
[摘要] 蜂窝静止（因此已知为G <子> 0 骤停）是由降低的DNA复制，增加自噬表征，并且增加的细胞周期蛋白依赖性激酶p27蛋白上标kip1 表达。静止对伤口愈合，器官再生和瘤形成是必不可少的。先前的发现表明微小RNA（miRNA）在调节细胞静止过程中起重要作用。我们最近的出版物静止期间以实例阐述在原代人替代miRNA生物途径包皮成纤维（HFF）细胞的存在。实际上，我们已经发现了一组与由trimethylguanosine合酶1（TGS1）蛋白的2,2,7- trimethylguanosine（TMG）带肩改性PRI-的miRNA（其成熟miRNA发现静止期期间诱导的）的并运输到细胞质通过Exportin-1（XPO1）蛋白质。我们用来抗体针对（TMG）兴趣盖（不与第（m交叉反应 7 G）兴趣帽了大部分PRI-的miRNA或mRNA的含有[鲁曼等人的，1982]），以从增殖或静态HFFS的总RNA提取RNA进行免疫沉淀。该测定的新颖性是PRI-miRNA的以及含有一个TMG-帽修改以外的非编码RNA的特异性分离。
【背景】蜂窝静止，类型可逆生长停滞的，是在伤口愈合，器官再生，和预防瘤形成涉及一种重要的细胞状态（科勒，2011;瓦尔古等人 2012）。已发现小的非编码RNA如miRNA参与细胞静止的调节。 ...
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