| Direct Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts to Conventional Type 1 Dendritic Cells by Enforced Expression of Transcription Factors
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] Ectopic expression of transcription factor combinations has been recently demonstrated to reprogram differentiated somatic cells towards the dendritic cell (DC) lineage without reversion to a multipotent state. DCs have the ability to induce potent and long-lasting adaptive immune responses. In particular, conventional type 1 DCs (cDC1s) excel on antigen cross-presentation, a critical step for inducing CD8+ T cell cytotoxic responses. The rarity of naturally occurring cDC1s and lack of in vitro methodologies for the generation of pure cDC1 populations strongly hinders the study of cDC1 lineage specification and function. Here, we describe a protocol for the generation of induced DCs (iDCs) by lentiviral-mediated expression of the transcription factors PU.1, IRF8 and ...
[摘要] [摘要] 转录因子组合的异位表达最近被证明可以将分化的体细胞重编程为树突状细胞（DC）谱系，而不会回复到多能状态。DC具有诱导有效和持久的适应性免疫应答的能力。在特定的常规类型1的DC（cDC1s）练成抗原交叉呈递，用于诱导CD8的关键步骤+ T细胞的细胞毒性应答。天然存在的cDC1的稀有性和缺乏用于生成纯cDC1群体的体外方法论，严重阻碍了对cDC1谱系规格和功能的研究。在这里，我们描述了用于生成感应DC（iDC）的协议 慢病毒介导的转录因子PU.1，IRF8和BATF3在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达。iDC 在9天内获得DC形态，cDC1表型和转录特征。使用此协议生成的iDC 具有对炎症刺激，吞噬死细胞，将抗原加工并交叉呈递给CD8 + T细胞的功能。DC重新编程提供了一个简单易处理的系统，可以生成大量的cDC1类细胞用于高内涵筛选，从而开辟了新途径，可以更好地了解cDC1的规格和功能。将来，在成纤维细胞中忠实诱导cDC1命运可能会导致产生患者特定的疫苗接种DC。
[背景技术树突状细胞（DC）是专业的抗原呈递细胞，专门用于识别，加工和呈递T细胞抗原，在诱导适应性免疫应答和免疫记忆中起关键作用（Me rad 等，2013）。DC可以分为4个主要子集：浆细胞样DC（pDC ），大量1型干扰素的产生者，循环单核细胞衍生的单核细胞衍生DC 和常规DC（cDC ...
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| FACS-based Glucose Uptake Assay of Mouse Embryonic Fibroblasts and Breast Cancer Cells Using 2-NBDG Probe
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This is a flow cytometry-based protocol to measure glucose uptake of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and breast cancer cells in vitro. The method is a slightly modified and updated version as previously described (Dong et al., 2017). Briefly, the target cells are incubated with the fluorescently tagged 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) for 2 h or 30 min, and the efficiency of glucose uptake is examined using a flow cytometer. This method can be adapted to measure a variety of adipocytes, immune cells, MEFs and cancer cells.
[摘要] 这是一种基于流式细胞术的方法，用于在体外测量小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和乳腺癌细胞的葡萄糖摄取。 该方法是稍微修改和更新的版本（Dong等人，2017）。 简言之，将靶细胞与荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-基-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）一起温育2小时或 30分钟，并使用流式细胞仪检查葡萄糖摄取的效率。 该方法可适用于测量各种脂肪细胞，免疫细胞，MEF和癌细胞。
【背景】葡萄糖是细胞的主要能量来源。葡萄糖转运蛋白家族（GLUT）负责跨葡萄糖转运葡萄糖（Kohn等人，1996）。葡萄糖摄取的变化可以反映细胞代谢的变化。例如，肿瘤细胞通常使用葡萄糖进行有氧糖酵解以支持其快速增殖。通常，与正常细胞相比，肿瘤细胞具有增加的葡萄糖摄取速率（Vander Heiden等人，2009）。 2-脱氧葡萄糖（2DG）是一种葡萄糖类似物，它以2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）的形式积累在细胞中。 2DG6P长期以来一直是测量葡萄糖摄取的黄金标准（Yamamoto et al。，2011）。尽管放射性标记的2DG6P的测量是敏感的，但许多研究人员避免了这种方法，因为放射性物质的处理和处置需要特殊的程序。
另一种不可代谢的葡萄糖类似物是荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）。该分子通过葡萄糖转运蛋白积聚在活细胞中，不会进入糖酵解途径。 ...
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