| Measurement of Protein-Protein Interactions through Microscale Thermophoresis (MST)
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] The binding interactions of PD-1 and PD-L1 have been studied by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC) over the past few years, but these investigations resulted in controversy regarding the values of the dissociation constant (Kd) (Freeman et al., 2000). MST is a powerful new method for the quantitative analysis of protein-protein interactions (PPIs) with low sample consumption. The technique is based on the movement of molecules along microscopic temperature gradients, and it detects changes in their hydration shell, charge or size. One binding partner is fluorescently labeled, while the other binding partner remains label-free. We used a protocol that allows the determination of the binding affinity by MST without purification of ...
[摘要] [摘要 ] 近年来，通过表面等离振子共振（SPR）和等温滴定热法（ITC）研究了PD-1和PD-L1的结合相互作用，但这些研究引起了解离常数值的争议。 （ķ d ）（弗里曼等人，2000） 。MST是一种功能强大的新方法，可定量分析低样品消耗的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。该技术基于分子沿微观温度梯度的移动，并检测其水合壳，电荷或大小的变化。一个结合蛋白摹伴侣荧光拉贝领导， 而另一个绑定伙伴仍保持无标签状态。我们使用的协议允许通过MST确定结合亲和力，而无需从细胞裂解物中纯化靶蛋白。将此MST方法应用于在CHO-K1细胞中表达的PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP的应用，首次使我们能够确定PD-1及其配体PD-L1之间形成的复合物的亲和力在肿瘤逃逸期间。该协议在研究蛋白质与小分子之间的相互作用方面具有多种潜在应用。
[背景技术 [ 0002 ] 鉴定能够调节PD-1和PD-L1之间形成的复合物的亲和力的化合物代表了针对肿瘤免疫逃逸的新疗法的开发的重大进展。该方案涉及eGFP 融合蛋白的过表达，然后从细胞裂解物中提取eGFP 融合蛋白，无需任何纯化步骤即可测定PD-1和PD-L1之间的亲和常数。因此，该协议的发展需要产生eGFP 融合蛋白。该协议旨在通过避免繁琐的纯化步骤来定量加速蛋白质相互作用的表征。该协议还可以用于通过PD-1 / ...
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| Visualization of RNA at the Single Cell Level by Fluorescent in situ Hybridization Coupled to Flow Cytometry
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] The protocol described here has been developed to detect RNA at the single cell level. Fluorescent probes hybridize to target RNAs and are detected by flow cytometry after multiple amplification steps. Different types of RNA can be detected such as mRNA, long noncoding RNA, viral RNA or telomere RNA and up to 4 different target probes can be used simultaneously. We used this protocol to specifically measure the expression of two transcription factor mRNAs, MAFB and IRF4, in human monocytes.
[摘要] 这里描述的方案已经被开发用于在单细胞水平上检测RNA。 荧光探针与目标RNA杂交，并在多个扩增步骤后通过流式细胞术检测。 可以检测不同类型的RNA，例如mRNA，长的非编码RNA，病毒RNA或端粒RNA，并且可以同时使用多达4种不同的靶探针。 我们使用该方案来特异性测量人单核细胞中两种转录因子mRNA，MAFB和IRF4的表达。
【背景】RT-qPCR是用于轻松评估RNA表达的一种主要技术。将细胞裂解并批量分析。因此，细胞异质性丧失。特别是，使用RT-qPCR来解决是否可以基于RNA的表达来鉴定亚群是不可能的。 RNA荧光原位杂交（FISH）是一种检测单细胞RNA的方法。该技术需要RNA靶标上的荧光探针杂交，然后使用成像系统如共聚焦显微镜检测。但是，这种方法非常耗时，并且可以分析有限数量的单个细胞。
我们通过RT-qPCR证实，在具有M-CSF，IL-4和TNFα的RPMI中培养的人单核细胞在三小时后表达转录因子MAFB和IRF4（Goudot等人，2017）。 MAFB和IRF4分别参与单核细胞向单核细胞衍生的巨噬细胞（mo-mac）和单核细胞衍生的DC（mo-DC）的分化。为了破译单核细胞是否表达两种转录因子，或者如果这种表达是互斥的，我们使用PrimeFlow RNA测定法进行与流式细胞术偶联的原位杂交。
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