| Methodology for in vitro Assessment of Human T Cell Activation and Blockade
|
|
Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Methods to test both the functionality and mechanism of action for human recombinant proteins and antibodies in vitro have been limited by multiple factors. To test the functionality of a recombinant protein or antibody, the receptor, the receptor-associated ligand, or both must be expressed by the cells present within the in vitro culture. While the use of transfected cell lines can circumvent this gap, the use of transfected cell lines does not allow for studying the native signaling pathway(s) modulated by the specific recombinant protein or antibody in primary cells. The present protocol utilizes sort purified CD14+ monocytes and T cells, both CD4+ T cells and CD8+ T cells, from healthy donors in a co-culture system. This methodology ...
[摘要] [摘要 ] 在体外测试人重组蛋白和抗体的功能和作用机理的方法受到多种因素的限制。要测试重组蛋白或抗体的功能，是受体，受体相关配体或两者它必须由体外培养物中存在的细胞表达，尽管使用转染的细胞系可以规避这一差距，但使用转染的细胞系并不能研究由特定重组蛋白或重组蛋白调控的天然信号通路（S）。抗体原代细胞，本协议利用排序纯化的CD14 Tasu 单核细胞和T细胞，这两种CD4 Tasu T细胞和CD8 Tasu T细胞，从他ALTH Ÿ 的捐助方共培养体系。这种方法特别相关的测试重组镨大肠菌素或抗体，是用于治疗自身免疫性疾病和癌症的推定疗法。目前的研究方案着重于含有B7-H4表达蛋白的共培养物 上皮细胞加上自体CD4 + T细胞或CD8 + T细胞，可以根据用户的特定需求修改方案。
背景 ] 临床使用检查点抑制剂治疗的，例如，抗CTLA-4和抗PD-1，已被证明可用作癌症治疗以增强抗肿瘤的免疫应答（柯伦等人，2010; 顾彬等等人，2014年），尽管在一线治疗失败的患者中获得成功，但仅约20％的接受治疗的患者对检查点抑制剂抗体治疗产生了反应，这种对患者无效的治疗可能是多因素的，也可能反映了特定类型。患者向临床医生提出的癌症（ Podojil等人，2020）。肿瘤细胞中存在的肿瘤细胞和单核细胞/巨噬细胞表达B7- ...
|
|
|
| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
|
|
Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
|
|
|
| In vitro Explant Cultures to Interrogate Signaling Pathways that Regulate Mouse Lung Development
|
|
Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Early mouse lung development, including specification of primordia, patterning of early endoderm and determination of regional progenitor cell fates, is tightly regulated. The ability to culture explanted embryonic lung tissue provides a tractable model to study cellular interactions and paracrine factors that regulate these processes. We provide up-to-date protocols for the establishment of this culture model and its application to investigate hedgehog signaling in the developing lung.
[摘要] 早期鼠肺发育，包括原基的规范，早期内胚层的构图和区域祖细胞命运的确定，受到严格的调控。 培养移植胚胎肺组织的能力提供了一种易处理的模型来研究调节这些过程的细胞相互作用和旁分泌因子。 我们提供最新的协议，以建立这种文化模式及其应用来研究肺部发育中的刺猬信号。
【背景】小鼠肺发育起始于前肠前内胚层的内胚层憩室（E9.5），随后关闭近端气管食管中隔以形成不同的气管和食道管（Minoo和King，1994）。原始内胚层管的随后分支通过E12.5产生平面肺结构，随后正交分支产生成熟肺的三维结构特征（Metzger等人，2008）。在E12.5之前分离的肺遗传的平面结构适合于在空气液体界面进行体外培养（Carraro等人，2010; Del Moral和Warburton， 2010）。胚胎肺通过解剖使用立体显微镜在亮场照明下或通过与谱系追踪和荧光报道分子偶联时的荧光照明进行分离。在这里，我们描述了使用Shh Cre / Rosa mTmG报告小鼠，其允许Cre介导的从约E8.75起在前部前肠内胚层内的膜定位的GFP的激活（Montgomery <等人，2007;高斯等人，2009; Yao等人，2017）。因此，肺内胚层通过红色荧光由绿色荧光和周围组织显现，从而允许清晰识别和显微切割包括肺在内的发育内胚层结构，并在体外培养期间成像。
|
|
|