| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
|
|
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
|
|
|
| Identification of Insertion Site by RESDA-PCR in Chlamydomonas Mutants Generated by AphVIII Random Insertional Mutagenesis
|
|
Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is frequently used as a model organism to study fundamental processes in photosynthesis, metabolism, and flagellar biology. Versatile tool boxes have been developed for this alga (Fuhrmann et al., 1999; Schroda et al., 2000; Schroda, 2006). Among them, forward genetic approach has been intensively used, mostly because of the high efficiency in the generation of hundreds of thousands of mutants by random insertional mutagenesis and the haploid nature therefore phenotypic analysis can be done in the first generation (Cagnon et al., 2013; Tunçay et al., 2013). A major bottleneck in the application of high throughput methods in a forward genetic approach is the identification of the genetic lesion(s) responsible for the ...
[摘要] 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是光合作用，代谢和鞭毛生物学的基础研究者。已经为这种藻类开发了多功能的工具箱（Fuhrmann等人，1999; Schroda等人，2000; Schroda，2006）。其中，正向遗传方法已经被广泛使用，主要是因为通过随机插入诱变产生了数十万个突变体的高效率，并且可以在第一代进行单倍体性质表型分析（Cagnon等人 2013，Tunçay et。 2013）。在正向遗传方法中应用高通量方法的主要瓶颈是鉴定与观察到的表型相关的遗传损伤。在该协议中，我们详细描述了最初在（González-Ballester等人，2005）中报道的限制性定点扩增PCR（RESDA-PCR）的改进版本。优化包括引物组合的优化，DNA聚合酶的选择，PCR循环参数的优化以及PCR产物直接测序的应用。这些修改使得获得特定的PCR产物变得更加容易，并且加速了亚克隆步骤以更快地获得测序数据。
【背景】除了限制酶位点定向扩增PCR（RESDA-PCR）（González-Ballester等人，2005）之外，还发现了其它几种分子技术。 包括Genome ...
|
|
|