| Buoyant Density Fractionation of Small Extracellular Vesicle Sub-populations Derived from Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] Small extracellular vesicles (sEVs) encompass a variety of distinct vesicles that are secreted to the extracellular space. Many methodologies currently used for EV isolation (e.g., differential ultracentrifugation concluding in a high-speed pellet, precipitation by macromolecular crowding agents or size excusion chromatography–SEC) do not fractionate distinct sEV sub-populations. Samples obtained by the aforementioned methods are usually used for characterization and physiological studies. However the fraction that contains the molecule of interest or is the carrier of a specific activity is unknown. Therefore isolating distinct sEV sub-populations is critical to understand EV function. The goal of this procedure is to purify distinct sEV sub-populations based on slight ...
[摘要] [摘要] 小细胞外小泡（sEVs）包括分泌到细胞外空间的各种不同的小泡。目前用于EV分离的许多方法（例如，高速颗粒中的差速超速离心、大分子拥挤剂沉淀或尺寸排除色谱法）没有分离不同的sEV亚群。通过上述方法获得的样品通常用于表征和生理学研究。然而，包含感兴趣分子或特定活性载体的部分是未知的。因此，分离不同的sEV亚群对于理解EV功能至关重要。该程序的目的是基于它们浮力密度的微小差异来纯化不同的sEV亚群。此外，该技术还允许从高速颗粒中共同分离的无囊泡RNA蛋白复合物中或通过使用拥挤剂来纯化sEVs。该方案描述了用于收集sEV的哺乳动物细胞的培养、sEV沉淀、sEV亚群的浮力密度分馏和sEV标记的免疫印迹。该方法可用于分离由多种哺乳动物细胞产生的不同的sEV亚群。
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| HIV-CRISPR: A CRISPR/Cas9 Screening Method to Identify Genes Affecting HIV Replication
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Screening with CRISPR/Cas9 technology has already led to significant discoveries in the fields of cancer biology, cell biology and virology. Because of the relatively low false discovery rates and the ability to perform high-throughput, pooled approaches, it has rapidly become the assay of choice for screening studies, including whole-genome screens. Here, we describe a CRISPR screening protocol that allows for efficient screening of the entire life cycle of HIV-1 through packaging of the HIV-CRISPR lentiviral genomes by infecting HIV-1 virus in trans.
[摘要] [摘要 ] CRISPR / Cas9技术的筛选已经在癌症生物学，细胞生物学和病毒学领域引起了重大发现。由于相对较低的错误发现率和执行高通量，合并方法的能力，它发展迅速。成为筛选研究（包括全基因组筛选）的首选检测方法。在此，我们描述了一种CRISPR筛选方案，该方案可通过感染HIV-CRISPR慢病毒基因组来包装，从而有效筛选HIV-1的整个生命周期。病毒1 在 跨。
[背景] 遗传筛选是鉴定影响包括人类免疫缺陷病毒（HIV）在内的病毒复制的新基因的有力工具。鉴定对HIV感染重要的宿主基因有助于增强对HIV复制，进化，传播和发病机制的认识，这是关键利益所在。特别是在过去十年中，通常是干扰素（IFN）刺激基因（ISG）的HIV限制因子的发现已成为逆转录病毒学领域的关键发展。限制因子已集中在过度表达筛选上，以鉴定作用广泛的抗病毒ISG （Schoggins 等，2011）或专门针对HIV的因子（Kane 等，2016）。通过转染对HIV限制因子进行了全基因组筛选siRNA的池池在靶细胞（刘等人，2011年）。然而，这些方法缺乏稳健性，Versa的钛Lity，和高通量方面 因此，我们使用CRISPR / Cas9技术开发了一种创新的ap 方法，并依靠HIV交叉包装通过CRISPR / Cas9文库转导的细胞中表达的慢病毒基因组的能力（OhAinle ...
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