| Human Endothelial Cell Spheroid-based Sprouting Angiogenesis Assay in Collagen
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones plays an important role during organ development, regeneration and tumor progression. The spheroid-based sprouting assay is a well-established and robust method to study the influence of genetic alterations or pharmacological compounds on capillary-like tube formation of primary cultured endothelial cells. A major advantage of this assay is the possibility to study angiogenesis in a 3D environment. Endothelial cells are cultured as hanging drops to form spheroids. Those spheroids are embedded into a collagen matrix and tube formation is analyzed 24 h later. By analyzing sprout number and sprout length the effects of genetic manipulation or drug treatment on angiogenesis can be investigated.
[摘要] 血管生成，从先前存在的血管形成新血管在器官发育，再生和肿瘤进展中起重要作用。 基于球体的发芽测定法是一种成熟且稳健的方法，用于研究遗传改变或药理学化合物对原代培养的内皮细胞的毛细血管样管形成的影响。 该测定的主要优点是可以在3D环境中研究血管生成。 将内皮细胞培养为悬滴以形成球状体。 将这些球状体嵌入胶原基质中，24小时后分析管形成。 通过分析发芽数和发芽长度，可以研究遗传操作或药物治疗对血管生成的影响。
【背景】血管为器官提供氧气和营养。在不再满足局部需求的情况下，细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）以诱导新血管的形成。新的容器芽由一个由茎细胞牵引的前端细胞组成（Potente和Makinen，2017）。血管生成在生理条件下（例如，肌肉和脂肪组织的生长）以及病理条件（例如，伤口愈合，黄斑变性和肿瘤生长）发生。因此，非常需要破译协调血管生成的基本机制并测试干扰病理性血管生成的化合物。
基于球体的发芽试验由Thomas Korff博士和Hellmut Augustin博士在90年代后期开发（Korff和Augustin，1999），使研究人员能够快速研究药物或基因操作对发芽血管生成的影响。稳健的方式（Heiss et al。，2015）。基于球体的发芽测定的一个重要优点是分析3D环境中的芽形成。这促进内皮细胞之间的细胞 - ...
|
|
|
| Quantification of Starch in Guard Cells of Arabidopsis thaliana
|
|
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] In this protocol, we describe how to quantify starch in guard cells of Arabidopsis thaliana using the fluorophore propidium iodide and confocal laser scanning microscopy. This simple method enables monitoring, with unprecedented resolution, the dynamics of starch in guard cells.
[摘要] 在该方案中，我们描述了如何使用荧光团碘化丙啶和共聚焦激光扫描显微镜来量化拟南芥保卫细胞中的淀粉。 这种简单的方法能够以前所未有的分辨率监测保卫细胞中淀粉的动态变化。
【背景】淀粉是葡萄糖的复合聚合物，代表植物储存碳水化合物的最丰富形式。淀粉根据其衍生的细胞类型和外部环境条件提供不同的功能。在控制水和二氧化碳与环境交换的气孔中边界的保卫细胞中，淀粉可在转变为光的几分钟内动员，有助于产生有机酸和糖，从而增加保卫细胞膨胀并促进气孔开放。在叶肉细胞中，淀粉通常在白天逐渐积累，并在夜间降解以支持代谢（Santelia和Lunn，2017）。
因为保卫细胞仅占总叶的一小部分，所以难以使用常规方法定量测量淀粉。到目前为止，保卫细胞中的淀粉积累主要通过碘染色显现。该技术可以确定淀粉的存在/不存在，但不能提供准确的定量信息。
在这里，我们描述了一种基于荧光的成像方法来量化拟南芥保护细胞中的淀粉。该技术基于细胞壁材料和其他葡聚糖底物（包括淀粉）与荧光假席夫试剂碘化丙啶（PS-PI）的共价标记。用高碘酸处理分离的表皮，以将葡萄糖单元的羟基氧化成醛和酮基团。然后醛基（-CHO）可以与碘化丙锭共价反应，产生具有高荧光葡聚糖的样品，非常适合于共聚焦激光扫描显微镜。保卫细胞叶绿体中单个淀粉颗粒的面积可以使用数字成像来确定。我们应用这种方法来评估完整的拟南芥叶片的保护细胞中的淀粉含量在昼夜循环中的动态变化，并确定fusicoccin（质子泵的化学活化剂）对淀粉量的影响。分离表皮的保卫细胞剥离漂浮在气孔开放缓冲液中的碎片（Horrer ...
|
|
|
| Mating Based Split-ubiquitin Assay for Detection of Protein Interactions
|
|
Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The mating based split-ubiquitin (mbSUS) assay is an alternative method to the classical yeast two-hybrid system with a number of advantages. The mbSUS assay relies on the ubiquitin-degradation pathway as a sensor for protein-protein interactions, and it is suitable for the determination of interactions between full-length proteins that are cytosolic or membrane-bound. Here we describe the mbSUS assay protocol which has been used for detecting the interaction between K+ channel and SNARE proteins (Grefen et al., 2010 and 2015; Zhang et al., 2015 and 2016)
[摘要] 基于交配的分ubiquitin（mbSUS）测定是具有许多优点的经典酵母双杂交系统的替代方法。 mbSUS测定依赖于泛素降解途径作为蛋白质 - 蛋白质相互作用的传感器，并且它适用于测定细胞溶质或膜结合的全长蛋白质之间的相互作用。在这里，我们描述了已经用于检测K + 通道和SNARE蛋白之间的相互作用的mbSUS测定方案（Grefen等人，2010和2015; Zhang 等等，2015和2016）
背景 图1是mbSUS测定的概况。泛素部分被分成两半，N末端半突变（NubG）以避免重组。泛素部分（Cub）的C末端一半与转录报告基因复合物PLV（Protein A-LexA-VP16）连接。两种蛋白质（X和Y）分别与NubG和CubPLV融合产生蛋白质 - 蛋白质相互作用分析系统。转化后，酵母菌株THY.AP5含有NubG-X融合蛋白，而酵母菌株THY.AP4含有Y-CubPLV融合蛋白。在交配后，在二倍体酵母中，如果蛋白质X和Y彼此相互作用，则将重新组装功能性泛素，这导致PLV的切割。释放的转录蛋白复合物PLV可以开启报告基因（ADE2，HIS3），并允许酵母生长在选择性培养基上。
...
|
|
|