| In vitro STING Activation with the cGAMP-STINGΔTM Signaling Complex
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Activating the STING (stimulator of interferon genes) signaling pathway via administration of STING agonist cyclic GMP-AMP (cGAMP) has shown great promise in cancer immunotherapy. While state-of-the-art approaches have predominantly focused on the encapsulation of cGAMP into liposomes or polymersomes for cellular delivery, we discovered that the recombinant STING protein lacking the transmembrane domain (STINGΔTM) could be used as a functional carrier for cGAMP delivery and elicit type I IFN expression in STING-deficient cell lines. Using this approach, we generated anti-tumoral immunity in mouse melanoma and colon cancer models, providing a potential translatable platform for STING agonist-based immunotherapy. Here, we report the detailed in vitro STING activation ...
[摘要] [摘要]通过给予STING激动剂环状GMP-AMP（cGAMP）激活STING（干扰素基因的刺激物）信号通路已显示出在癌症免疫治疗中的广阔前景。尽管目前最先进的方法主要集中在将cGAMP封装进脂质体或聚合物小体中以进行细胞递送，但我们发现缺少跨膜结构域（STINGΔTM）的重组STING蛋白可以用作cGAMP递送的功能载体。在STING缺陷型细胞系中诱导I型IFN表达。使用这种方法，我们在小鼠黑素瘤和结肠癌模型中产生了抗肿瘤免疫力，为基于STING激动剂的免疫疗法提供了潜在的可翻译平台。在这里，我们报告与cGAMP-STINGΔTM复合物的详细体外STING激活方案，以帮助研究人员进一步开发这种方法。该协议还可以轻松扩展到与STING激活相关的其他应用程序，例如控制各种类型的感染。
[背景]在过去的二十年中，STING（干扰素基因的刺激物）信号传导途径已成为免疫系统的关键特征，并有望成为针对病毒和细菌感染，自身免疫性疾病和癌症的治疗靶标。因此，递送STING激动剂以增强免疫应答已经成为学术机构和制药公司的极大兴趣领域（Ohkuri等人，2017）。尽管现有的努力主要集中在开发合成运载工具上（Shae et ...
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| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
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| Tracking Endocytosis and Intracellular Trafficking of Epitope-tagged Syntaxin 3 by Antibody Feeding in Live, Polarized MDCK Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The uptake and trafficking of cell surface receptors can be monitored by a technique called ‘antibody-feeding’ which uses an externally applied antibody to label the receptor on the surface of cultured, live cells. Here, we adapt the traditional antibody-feeding experiment to polarized epithelial cells (Madin-Darby Canine Kidney) grown on permeable Transwell supports. By adding two tandem extracellular Myc epitope tags to the C-terminus of the SNARE protein syntaxin 3 (Stx3), we provided a site where an antibody could bind, allowing us to perform antibody-feeding experiments on cells with distinct apical and basolateral membranes. With this procedure, we observed the endocytosis and intracellular trafficking of Stx3. Specifically, we assessed the internalization rate of Stx3 from the ...
[摘要] 细胞表面受体的摄取和贩卖可以通过被称为“抗体 - 进纸”技术，其在外部使用上应用的抗体来标记培养的活细胞的表面上的受体进行监测。在这里，我们适应传统的抗体喂养实验极化上皮细胞（Madin-Darby犬肾）生长在透性transwell支持。通过添加两个串联胞外Myc表位标签的SNARE蛋白突触3（Stx3）的C末端，我们提供了一种站点，其中与抗体可以结合，使我们能够用不同的顶端和基底外侧膜对细胞进行抗体 - 喂养实验。通过这个程序，我们观察到Stx3的内吞和细胞内运输。具体而言，我们评估从基底外侧膜Stx3的内在化速率和在时间和空间上使用固定在不同时间点的细胞免疫荧光显微镜随后的内吞观察路径。为此，介绍了以下可追踪单层的贩运行为：来自限制膜的靶蛋白。
【背景】SNARE蛋白突触3（Stx3）是已知的建立在极化上皮细胞顶端 - 基底极性（低等人，1996年Delgrossi 等人，1997年Weimbs 等人，1997;低等人，1998;黎等人，2002;低等人
一个典型的12孔细胞培养皿的阱内的transwell小室的聚碳酸酯膜的细胞培养插入物的图1示意图。斯特朗细胞是在膜的顶部和培养将形成紧密的单层做密封关聚碳酸酯膜将顶端介质隔室与基底外侧介质隔室分开。 ...
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