| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo protein into transport vesicles at the TGN under specific experimental conditions.
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| Chromatin Affinity Purification (ChAP) from Arabidopsis thaliana Rosette Leaves Using in vivo Biotinylation System
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Author:
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2018-01-05
[Abstract] Chromatin Affinity Purification (ChAP) is widely used to study chromatin architecture and protein complexes interacting with DNA. Here we present an efficient method for ChAP from Arabidopsis thaliana rosette leaves, in which in vivo biotinylation system is used. The chromatin is digested by Micrococcal Nuclease (MNase), hence the distribution of nucleosomes is also achieved. The in vivo biotinylation system was initially developed for Drosophila melanogaster (Mito et al., 2005), but the presented protocol has been developed specifically for Arabidopsis thaliana (Sura et al., 2017).
[摘要] 染色质亲和纯化（ChAP）被广泛用于研究染色质结构和与DNA相互作用的蛋白质复合物。 在这里，我们提出了一种有效的从拟南芥莲座叶中ChAP的方法，其中使用了体内生物素化系统。 染色质被Micrococcal核酸酶（MNase）消化，因此核小体的分布也被实现。 体内生物素化系统最初是为黑腹果蝇而开发的（Mito et al。2005），但是所提出的方案是专门为 拟南芥（Sura et。，2017）。
【背景】染色质免疫沉淀（ChIP）成为研究染色质结构和组织的最重要和最常用的技术之一。但是，它需要高质量的抗体，不会与非特异性靶标发生交叉反应。在含有细胞壁并富含光合作用相关化合物和蛋白质的植物中，这是相当难以实现的，这些化合物和蛋白质经常引起交叉反应性问题。另一方面，获得稳定的转基因生物是植物常规和容易的策略。由于这些原因，大多数植物研究人员选择基因标签，获得融合蛋白，并用ChIP替代方法即染色质亲和纯化（ChAP）来研究染色质。 ChAP技术已被证明在植物染色质研究中非常有效（Zentner和Henikoff，2014）。此外，它通常比经典ChIP便宜，因为它不需要产生抗体，并且通常比ChIP更有效，因为标签以比直接针对感兴趣的蛋白质产生的抗体更高的亲和力被识别。 ...
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| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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