| In vitro Dephosphorylation Assay of c-Myc
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] This protocol describes experimental procedures for in vitro dephosphorylation assay of human protein c-Myc. This protocol can be adapted to detect phosphatase activity of other Ser/Thr phosphatases.
[摘要] 该方案描述了人蛋白质c-Myc的体外去磷酸化测定的实验程序。 该方案可适用于检测其他Ser / Thr磷酸酶的磷酸酶活性。
【背景】羧基末端结构域RNA聚合酶II多肽小型磷酸酶1（SCP1，也称为CTDSP1或NLI-IF）属于FCP / SCP磷酸酶家族，最初被报道使RNA聚合酶II的C-末端结构域（CTD）脱磷酸化 （Yeo等，2003）。 Smad2,3（Wrighton等，2006），Snail（Wu等，2009），PML（Lin等，2014）和c-Myc（Wang等，2016）也被鉴定为底物 的SCP1。
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| Activity-based Pull-down of Proteolytic Standard and Immunoproteasome Subunits
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western blot, tandem mass spectrometry (Li et al., 2013), or alternative techniques.
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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| Subcellular Fractionation of Mouse Brain Homogenates
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Author:
Date:
2013-08-05
[Abstract] This subcellular fractionation protocol is used for separation of cellular organelles based on their density. We have designed and optimized the protocol for separation of subcellular compartments of brain homogenates with focus on the localization and trafficking of transmembrane proteins, but we have also successfully used this protocol for fractionation of other types of tissue. The protocol has two major steps 1) preparation of homogenate from dissected tissue and 2) separation of organelles by centrifugation of homogenates using a continuous sucrose gradient.
[摘要] 这种亚细胞分馏方案用于根据细胞密度分离细胞器。 我们设计和优化了用于分离脑匀浆物的亚细胞区域的方案，重点是跨膜蛋白的定位和运输，但是我们也已经成功地使用该方案来分离其他类型的组织。 方案有两个主要步骤：1）从解剖组织制备匀浆物; 2）通过使用连续蔗糖梯度离心匀浆分离细胞器。
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