| Murine Bronchoalveolar Lavage
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] A basic Bronchoalveolar lavage (BAL) procedure in mouse is described here. Cells and fluids obtained from BAL can be analyzed by Hema3-staining, immunostaining, Fluorescence-activated cell sorting (FACS), PCR, bicinchoninic acid protein assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), luminex assays, etc., to examine the immune cells, pathogens, proteins such as cytokines/chemokines, and the expression levels of inflammation-related and other genes in the cells. This will help to understand the underlying mechanisms of these lung diseases and develop specific and effective drugs.
[摘要] 这里描述了小鼠中基本的支气管肺泡灌洗（BAL）程序。可以通过Hema3染色，免疫染色，荧光激活细胞分选（FACS），PCR，二金鸡宁酸蛋白测定，酶联免疫吸附测定（ELISA），luminex检测等来分析从BAL获得的细胞和液体。 / em>，以检查免疫细胞，病原体，蛋白质如细胞因子/趋化因子，以及细胞中炎症相关基因和其他基因的表达水平。这将有助于了解这些肺部疾病的潜在机制，并开发具体有效的药物。
背景 支气管肺泡灌洗（BAL）是通常用于诊断肺部疾病（包括肺癌）的简单且典型的方法（Daubeuf和Frossard，2012）。它用于采样肺组分，以确定肺中的蛋白质组成，免疫细胞和病原体。肺部慢性炎症在肺癌起始和进展中起关键作用。为了阐明肺肿瘤发生的炎症的潜在机制，我们的实验室使用了一种基本的BAL方案来确定肺部免疫反应（Qu等人，2015; Zhou等）。 ，2015; Sun等人，2016; Zhou等人，2017）。
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| Isolation of the Dot/Icm Type IV Secretion System Core Complex from Legionella pneumophila for Negative Stain Electron Microscopy Studies
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Legionella possesses a pivotal secretion machinery to deliver virulence factors to eukaryotic host cells. In this protocol, we describe the procedure for isolation of the native core complex of the Dot/Icm type IV secretion system from L. pneumophila aiming to perform biochemical and transmission electron microscopy analyses.
[摘要] 军团菌具有关键的分泌机制，以将毒力因子递送至真核宿主细胞。在本协议中，我们描述了从L / L分离Dot / Icm IV型分泌系统的天然核心复合物的步骤。肺炎支原体旨在进行生物化学和透射电子显微镜分析。
嗜肺军团菌是革兰氏阴性细菌病原体，其导致被称为退伍军人病的肺部感染（Fields等人，2002）。 L。嗜肺杆菌利用由 dot / cm 基因编码的IV型分泌系统（T4SS）将大约300种细菌蛋白转运到其真核宿主细胞质中以劫持细胞过程（Hubber和Roy， 2010）。由超过20种蛋白组成，T4SS是建立在细菌内膜和外膜上的纳米机器（Nagai和Kubori 2011; Kubori和Nagai 2016）。 Dot / Icm T4SS的核心复合物是系统的生物化学稳定部分，并形成桥接内膜和外膜的输送导管（Kubori等人，2014）。核心复合物由至少五种蛋白质组成;三种外膜相关蛋白，DotC，DotD和DotH，以及两种内膜蛋白DotF和DotG（Vincent等人，2006）。基于来自鼠伤寒沙门氏菌的另一种细菌纳米机械的III型分泌系统的生物化学分离方法（Kubori等人，1998; Marlovits等人， ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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