| Design of Hybrid RNA Polymerase III Promoters for Efficient CRISPR-Cas9 Function
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The discovery of the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes has allowed the development of genome engineering tools in a variety of organisms. A frequent limitation in CRISPR-Cas9 function is adequate expression levels of sgRNA. This protocol provides a strategy to construct hybrid RNA polymerase III (Pol III) promoters that facilitate high expression of sgRNA and improved CRISPR-Cas9 function. We provide selection criteria of Pol III promoters, efficient promoter construction methods, and a sample screening technique to test the efficiency of the hybrid promoters. A hybrid promoter system developed for Yarrowia lipolytica will serve as a model.
[摘要] 来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9系统的发现使得在各种生物体中开发基因组工程工具成为可能。 CRISPR-Cas9功能的频繁限制是足够的sgRNA表达水平。 该协议提供了构建杂合RNA聚合酶III（Pol III）启动子的策略，其促进sgRNA的高表达和改善的CRISPR-Cas9功能。 我们提供Pol III启动子的选择标准，有效的启动子构建方法以及样品筛选技术来检测杂合启动子的效率。 为解脂耶氏酵母开发的杂交启动子系统将用作模型。
【背景】CRISPR（成簇定期间隔短回文重复序列）是细菌中发现的DNA序列的集合，其中含有先前曝光的病毒DNA片段（Marraffini和Sontheimer，2010）。片段被称为间隔区DNA，并且它们侧面是短的，重复的回文序列。细菌使用这些存储的间隔序列作为模板来表达RNA，以识别和攻击再次暴露的特定病毒。当与CRISPR相关（Cas）蛋白结合时，CRISPR-Cas系统可以识别和切割外源DNA或RNA，破坏病毒并保护宿主免受重复感染（Barrangou，2013）。
一种特定的CRISPR系统，来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas9已经被修改成用于基因组编辑的更简单的系统。利用这个系统，研究人员能够设计特定的单引导RNA（sgRNA）序列，它与具有上游原型间隔区相邻基序（PAM;'NGG'）的目的基因的20bp序列互补（Jinek ...
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| In vitro Homeostatic Proliferation of Human CD8 T Cells
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Long-lived T-cell–mediated immunity requires persistence of memory T cells in an antigen-free environment while also maintaining a heightened capacity to recall effector functions. Such antigen-independent homeostatic proliferation is mediated in part by the common gamma-chain cytokines IL-7 and IL-15. To further explore the mechanisms governing maintenance of effector functions in long-lived memory T cells during antigen-independent proliferation, human naïve and memory CD8 T cells can be sorted from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), labeled with the proliferation-tracking dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), and then purified based on their levels of cell division. This allows investigators to assess differences in the desired molecular target in cells that have ...
[摘要] 长寿T细胞介导的免疫需要在无抗原环境中持续存在记忆T细胞，同时还保持提高的回忆效应器功能的能力。这种不依赖于抗原的体内平衡增殖部分由常见的γ链细胞因子IL-7和IL-15介导。为了进一步探索在抗原非依赖性增殖过程中维持长效记忆T细胞中效应子功能的机制，可以从外周血单核细胞（PBMCs）中分选人幼稚和记忆CD8T细胞，用增殖跟踪染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），然后根据它们的细胞分裂水平进行纯化。这使得研究人员能够评估经历细胞因子驱动的增殖的细胞中期望的分子靶点的差异。我们在这里提供了一个协议，用于评估在分裂和未分裂的人类幼稚和记忆CD8 T细胞中的表观遗传程序，在用IL-7和IL-15培养7天之后，以说明这种方法如何阐明控制在长寿记忆CD8T细胞的稳态期间保持效应子功能。
【背景】获得性免疫的一个主要特征是对先前遇到的病原体的免疫记忆的发展（Plotkin等人，2013）。记忆CD8 T细胞在为宿主以前遇到的病原体提供终生保护方面发挥重要作用，但为了提供长寿命的保护，T细胞必须已经获得了在无抗原中持续并保持效应功能的能力环境。在此期间，记忆T细胞响应于IL-7/15细胞因子进行抗原非依赖性增殖，尽管程度不同。
记忆CD8 T细胞的总池是几种不同的细胞亚群的异质组合，其对稳态细胞因子的反应不同。例如，CD8 ...
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