| Preparation of Cerebellum Granule Neurons from Mouse or Rat Pups and Evaluation of Clostridial Neurotoxin Activity and Their Inhibitors by Western Blot and Immunohistochemistry
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Cerebellar Granule Neurons (CGN) from post-natal rodents have been widely used as a model to study neuronal development, physiology and pathology. CGN cultured in vitro maintain the same features displayed in vivo by mature cerebellar granule cells, including the development of a dense neuritic network, neuronal activity, neurotransmitter release and the expression of neuronal protein markers. Moreover, CGN represent a convenient model for the study of Clostridial Neurotoxins (CNT), most notably known as Tetanus and Botulinum neurotoxins, as they abundantly express both CNT receptors and intraneuronal substrates, i.e., Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptors (SNARE proteins). Here, we describe a protocol for obtaining a highly pure ...
[摘要] 来自产后啮齿动物的小脑颗粒神经元（CGN）已被广泛用作研究神经元发育，生理学和病理学的模型。 CGN体外培养维持成熟小脑颗粒细胞在体内显示的相同特征，包括发育致密的神经炎网络，神经元活动，神经递质释放和神经元的表达 蛋白质标记。 此外，CGN代表了梭菌神经毒素（CNT）研究的便利模型，最着名的是破伤风和肉毒杆菌神经毒素，因为它们大量表达CNT受体和神经元内基质， ie ，可溶性N-乙基马来酰亚胺 - 敏感因子激活蛋白受体（SNARE蛋白）。 在这里，我们描述了从出生后大鼠/小鼠获得高纯度CGN培养物的方案和用CNT中毒的简便方法。 我们还说明了评估CNT活性及其抑制的方便方法。
【背景】梭菌神经毒素（CNT）的大家族由破伤风神经毒素（TeNT）和肉毒杆菌神经毒素（BoNT）的多种变体形成，它们分别是破伤风和肉毒中毒的神经麻痹毒素（Schiavo et al。，2000; Johnson和Montecucco，2008; Rossetto et al。，2014）。 TeNT，七种BoNT血清型（BoNT / A至/ G）及其许多亚型是金属蛋白酶，通过切割SNARE蛋白（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子激活蛋白受体），三种必需蛋白质来阻断神经递质的释放而引起神经麻痹。控制突触小泡与突触前质膜的融合（Rossetto et al。，2014; ...
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| Quantification of Extracellular Double-stranded RNA Uptake and Subcellular Localization Using Flow Cytometry and Confocal Microscopy
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Double-stranded RNA is a potent pathogen-associated molecular pattern (PAMP) produced as a by-product of viral replication and a well-known hallmark of viral infection. Viral dsRNAs can be released from infected cells into the extracellular space and internalized by neighboring cells via endocytosis. Mammals possess multiple pattern recognition receptors (PRRs) capable of detecting viral dsRNAs such as endosomal toll-like receptor 3 (TLR3) and cytosolic RIG-I-like receptors (RLRs) which lead to the production of type I interferons (IFNs). Thus, intracellular localization of viral dsRNA can provide insight into the downstream signaling pathways leading to innate immune activation. Here, we describe a quantitative method for measuring extracellular dsRNA uptake and visualizing subcellular ...
[摘要] 双链RNA是一种有效的病原体相关分子模式（PAMP），作为病毒复制的副产物和病毒感染的众所周知的标志产生。 病毒dsRNA可以从感染的细胞释放到细胞外空间并通过胞吞作用被邻近细胞内化。 哺乳动物具有能够检测导致产生I型干扰素（IFN）的病毒dsRNA（例如内体Toll样受体3（TLR3）和胞质RIG-1样受体（RLR））的多模式识别受体（PRR）。 因此，病毒dsRNA的细胞内定位可以提供对导致先天免疫激活的下游信号传导途径的了解。 在这里，我们描述了一种测量细胞外dsRNA摄取和分别通过流式细胞仪和共聚焦显微镜观察内化dsRNA的亚细胞定位的定量方法。
【背景】双链RNA（dsRNA）是病毒复制的常见副产物，通过产生I型干扰素（IFN）和其他促炎细胞因子（Nellimarla和Mossman，2014）是抗病毒免疫的有效激活剂。病毒的dsRNA通过TLR3核内体内所感测（松本等人，2003年）或在由RIG-I样受体（RLRS），RIG-I和MDA-5（加藤等人，2006）。在裂解感染，这些dsRNA可以被释放到细胞外空间，它们结合于相邻小区，如A类清道夫受体（SR-A）和RAFTLIN表面受体，并且随后经由网格蛋白介导的内吞作用内在化（伊藤制 2008; DeWitte-Orr等人，2010; Watanabe等人，2011; Dansako等人，， ...
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| Virucidal and Neutralizing Activity Tests for Antiviral Substances and Antibodies
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] In a narrow definition, virucidal activity represents the activity by which to interact with and physically disrupt viral particles. In a broad definition, it includes the activity by which to functionally inhibit (neutralize) viral infectivity without apparent morphological alterations of the viral particles. The viral infectivity can be measured in cell culture system by means of plaque assay, infectious focus assay, 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay, etc. Morphologically, disruption of viral particles can be demonstrated by negative staining electron microscopic analysis of viral particles. In this article, we describe methods to assess virucidal activity in a broad definition.
[摘要] 在狭义定义中，杀病毒活性表示与病毒颗粒相互作用和物理破坏的活性。 在一个广义的定义中，它包括了功能上抑制（中和）病毒感染性而没有病毒颗粒的明显形态改变的活性。 可以通过噬菌斑测定，感染性聚焦测定，50％组织培养感染剂量（TCID 50）测定，等等在细胞培养系统中测量病毒感染性。 形态学上，病毒颗粒的破坏可以通过病毒颗粒的负染色电子显微镜分析来证明。 在这篇文章中，我们描述了用广义定义评估杀病毒活性的方法。
【背景】病毒是细胞内寄生虫，它们劫持宿主细胞机制来复制它们自己的基因组。在病毒生命周期的最初阶段，感染性病毒颗粒附着（结合）到靶细胞表面上的称为病毒受体的特定宿主蛋白，然后病毒渗透（内化和/或融合）到细胞的细胞内区室宿主细胞，其中病毒生命周期的后续步骤继续产生后代病毒体（Scheel和Rice，2013）。
狭义定义中的杀病毒活性表示与病毒颗粒相互作用和物理破坏的活性。在一个广义的定义中，它包括与病毒感染性相互作用并在功能上抑制（中和）病毒感染性而没有病毒颗粒的明显形态改变的活性，如抗体介导的中和的情况。
最近我们报道了从蛇毒（Chen等，2017）获得的分泌型磷脂酶Aβ的异构体和来自蝎毒（El-Bitar ...
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