| DigiTAG–a RNA Sequencing Approach to Analyze Transcriptomes of Rare Cell Populations in Drosophila melanogaster
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Cell-type specific transcriptional programs underlie the development and maintenance of organs. Not only distinct cell types within a tissue, even cells with supposedly identical cell fates show a high degree of transcriptional heterogeneity. Inevitable, low cell numbers are a major hurdle to study transcriptomes of pure cell populations. Here we describe DigiTAG, a high-throughput method that combines transposase fragmentation and molecular barcoding to retrieve high quality transcriptome data of rare cell types in Drosophila melanogaster. The protocol showcases how DigiTAG can be used to analyse the transcriptome of rare neural stem cells (type II neuroblasts) of Drosophila larval brains, but can also be utilized for other cell types or model systems.
[摘要] [摘要]细胞类型的特定转录程序是器官的发育和维持的基础。不仅组织内不同的细胞类型，甚至具有相同细胞命运的细胞也显示出高度的转录异质性。不可避免的是，低细胞数量是研究纯细胞群体转录组的主要障碍。在这里，我们介绍DigiTAG ，这是一种高通量方法，将转座酶片段化和分子条形码相结合，以检索果蝇中稀有细胞类型的高质量转录组数据。该协议展示了DigiTAG如何可用于分析果蝇幼虫的罕见神经干细胞（II型成神经细胞）的转录组 大脑，但也可以用于其他细胞类型或模型系统。
[背景]在发育过程中，不同细胞类型之间的过渡与组织稳态之间的关系是由大量转录因子及其诱导的转录变化所精心安排的。在过去的十年中，RNA测序（RNA- seq ）已成为测量整个基因组转录动力学的经典方法（Stark等，2019）。组织上的大量RNA序列不允许研究不同细胞群体的转录网络，特别是稀有细胞类型的转录网络。因此，需要提供低输入样品高质量转录组的RNA- seq方案。
在果蝇中，有限的材料通常构成分析特定组织或细胞类型的障碍。果蝇神经干细胞（称为神经母细胞）很好地说明了这一点（Homem和Knoblich ，2012）。存在成神经细胞的几个不同的亚群。例如，在果蝇的幼虫大脑中，只有16种II型成神经细胞产生神经元，神经元支配了运动和感觉处理所需的大脑区域（Walsh and ...
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| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
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| Oral Microbiome Characterization in Murine Models
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] The oral microbiome has been implicated as a trigger for immune responsiveness in the oral cavity, particularly in the setting of the inflammatory disease periodontitis. The protocol presented here is aimed at characterizing the oral microbiome in murine models at steady state and during perturbations of immunity or physiology. Herein, we describe murine oral microbiome sampling procedures, processing of low biomass samples and subsequent microbiome characterization based on 16S rRNA gene sequencing.
[摘要] 口腔微生物组被认为是口腔免疫应答的触发因素，特别是在炎性疾病牙周炎的形成中。 这里提出的协议旨在描述在稳定状态和扰动免疫或生理学的小鼠模型中的口腔微生物群。 在此，我们描述了鼠类口腔微生物群落取样程序，低生物量样品的处理和随后的基于16S rRNA基因测序的微生物群鉴定。
【背景】微生物组在调节组织特异性免疫应答（特别是在屏障部位）中起关键作用（Belkaid和Harrison，2017）。在这些屏障环境中，例如胃肠道和皮肤，选择的共生物显示能够驱动特定免疫细胞群体的发育（Ivanov等人，2009; Naik等人。，2012）。我们的工作最近开始探索口腔微生物组在剪裁组织免疫力方面的影响，尤其是在牙龈处，一个脆弱的口腔屏障部位（Abusleme和Moutsopoulos，2016; Dutzan等人，2017）。
在人类中，众所周知口腔中含有丰富多样的微生物（Human Microbiome Project，2012）。口腔微生物群落的改变与常见的口腔疾病，牙周炎（一种影响牙龈组织并导致组织损伤的炎症）有关（Griffen等人，2012; Abusleme等人。，2013; Moutsopoulos et al 。，2015）。迄今为止，动物模型已经有助于解决微生物组在各种生理和病理条件中的作用（Turnbaugh等人，2006; ...
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