| Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector generation, data acquisition, processing, and analysis using the R environment. Our protocol enables high-resolution measurements of miRNA induced post-transcriptional gene regulation and combined with ...
[摘要] MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究，一些研究采用基于荧光素酶的报告基因，通常测量全细胞群，其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里，我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程，包括：使用R环境进行矢量生成，数据采集，处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量，并结合系统生物学，可用于估计miRNA的熟练程度。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是高度保守的小型非蛋白质编码RNA（21-22nt），可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程，如发育和细胞稳态（Lagos-Quintana et al。，2001; Fabian et al。，2010; Bartel，2018），包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理（Lu et al。， 2005; Di Leva和Croce，2013; Krishnan et al。，2015; Bertoli et ...
|
|
|
| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
|
|
Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective system to assess the function of DGCs and PDEs in E. coli. This system utilizes the high specificity of a riboswitch to c-di-GMP and its ability to regulate the expression of a downstream ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
|
|
|