| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived from healthy donors to differentiate into human primary airway epithelium for cellular and molecular-based studies. Further, basal stem cells can be harvested from patients with a specific airway ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
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| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC clones.
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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