| Multiplex T-cell Stimulation Assay Utilizing a T-cell Activation Reporter-based Detection System
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Immune tolerance and response are both largely driven by the interactions between the major histocompatibility complex (MHC) expressed by antigen presenting cells (APCs), T-cell receptors (TCRs) on T-cells, and their cognate antigens. Disordered interactions cause the pathogenesis of autoimmune diseases such as type 1 diabetes. Therefore, the identification of antigenic epitopes of autoreactive T-cells leads to important advances in therapeutics and biomarkers. Next-generation sequencing methods allow for the rapid identification of thousands of TCR clonotypes from single T-cells, and thus there is a need to determine cognate antigens for identified TCRs. This protocol describes a reporter system of T-cell activation where the fluorescent reporter protein ZsGreen-1 is driven by nuclear ...
[摘要] [摘要] 免疫耐受和应答都很大程度上由抗原呈递细胞（APC）表达的主要组织相容性复合物（MHC），T细胞上的T细胞受体（TCR）及其同源抗原之间的相互作用驱动。相互作用障碍导致自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的发病机理。因此，鉴定自身反应性T细胞的抗原表位导致治疗和生物标志物的重要进展。下一代测序方法可从单个T细胞快速鉴定数千种TCR克隆型，因此需要确定已鉴定TCR的同源抗原。该协议描述了T细胞活化的报告系统，其中荧光报告蛋白ZsGreen-1由活化T细胞的核因子（NFAT）信号驱动并通过流式细胞仪读取。记者T细胞也组成性表达额外的一对荧光素tein作为识别物，允许同时多路复用多达8种不同的报告T细胞系，每种表达不同的目标TCR，可通过流式细胞仪区分。一旦制成TCR表达细胞系，仅需一个转导步骤即可将其无限期用于制备新的T细胞系。这种多路复用系统允许筛选TCR-抗原相互作用的数量，否则这些相互作用将是不切实际的，可在多种情况下使用（即，筛选单个抗原或抗原库），并可用于研究任何T细胞-MHC-抗原三分子相互作用。
[背景] T细胞，抗原呈递细胞（APC）及其同源抗原之间的相互作用是自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的主要事件（Michels等，2017； ...
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| Generation of microRNA Sponge Library
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This protocol describes the generation and functional validation of microRNA (miRNA) sponge or decoy constructs. When expressed from a strong promoter, these transcripts can sequester specific miRNA:RISC complexes, thereby resulting in a derepression of endogenous target mRNA. Hence, cells expressing such sponges display a partial or full miRNA loss-of-function phenotype.
Depending on the sponge sequence, the activity of any miRNA of choice can be inhibited by sponge sequestration, but it should be noted that these constructs do not seem to be specific for one particular miRNA. Rather, all miRNAs of the same family as defined by the seed sequence will be affected, albeit to a different degree.
[摘要] 该协议描述了microRNA（miRNA）海绵或诱饵构建体的产生和功能验证。 当从强启动子表达时，这些转录物可以隔离特定的miRNA：RISC复合物，从而导致内源性靶mRNA的去阻遏。 因此，表达这种海绵的细胞表现出部分或完全的miRNA功能丧失表型。
根据海绵序列的不同，所选择的miRNA的活性可以通过海绵螯合来抑制，但是应该指出，这些构建体对于一种特定的miRNA似乎并不是特异性的。 相反，由种子序列定义的同一家族的所有miRNA将受到影响，尽管程度不同。
【背景】微小RNA（miRNA）是短的非编码RNA，其大小约为21-24个核苷酸，其在转录后沉默哺乳动物中所有蛋白质编码基因的大部分。自从他们发现以来，越来越多的研究已经清楚地将这个监管层确定为几乎所有生理过程的关键要素。在这种情况下并不奇怪，miRNA的异常表达也与几种人类恶性肿瘤包括癌症有因果关系。
使用经典的功能增益方法，早期研究通常利用过表达来评估特定miRNA的功能。然而，与生理环境相比，这可以达到高达100倍或更高的miRNA水平，并且可能产生不一定与miRNA的正常功能相关的表型。
为了避免可能的过度表达伪影的这个显而易见的问题，在过去几年中已经开发了用于体内和体内使用的miRNA抑制的几种技术，从而允许分析一种特定的miRNA或一组miRNA以功能丧失的方式。这些包括例如miRNA诱饵或海绵的表达，通过以序列特异性方式隔离miRNA：RISC复合物来干扰miRNA功能的长转录物（Ebert等人。 ...
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| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or restriction site loss.
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
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