| Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also include a brief description of hippocampal culture. In the end, we briefly discuss the commonality and difference among FM dye, pH-sensitive fluorescent proteins and quantum dots in terms of measuring ...
[摘要] 突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解，直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的，其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后，我们简要讨论FM染料，pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的，因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量，释放概率，融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具，包括突触后神经元的电生理学记录，膜运输的电容测量，可氧化的发射体的电流分析，固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中，最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息，而且提供高吞吐量（即，来自不同神经元的单个突触的更多数据点）的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料（即FM染料，包括FM1-43，FM4-64，FM5-95）仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放，可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD，FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里，我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外，我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...
|
|
|
| D-serine Measurements in Brain Slices or Other Tissue Explants
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] D-serine is an atypical amino acid present in the mammalian body (most amino acids in the mammalian body are L-isomers) that is mostly known in neuroscience for its role as a co-agonist controlling the N-methyl D-aspartate receptor (NMDAR). D-serine levels are decreased in patients with schizophrenia and this is thought to mediate, at least in part, the hypofunction of NMDARs that is central to the glutamate hypothesis for the etiology of this neuropsychiatric disorder. D-serine detection was first established using high performance liquid chromatography, a costly and complex technique that requires high levels of expertise. But with the increasing interest in this unconventional amino acid, there is an increasing need for easier, cheaper and more accessible detection methods. Here we ...
[摘要] D-丝氨酸是存在于哺乳动物体内的非典型氨基酸（哺乳动物体内的大部分氨基酸是L-异构体），其在神经科学中主要是作为控制N-甲基D-天冬氨酸受体的共激动剂的作用而已知的NMDA受体）。精神分裂症患者的D-丝氨酸水平降低，这被认为至少部分地介导了NMDARs功能减退，这种谷氨酸假说对于这种神经精神障碍的病因至关重要。 D-丝氨酸检测首先使用高效液相色谱法建立，这是一种昂贵且复杂的技术，需要高水平的专业知识。但随着对这种非常规氨基酸的兴趣日益增加，人们越来越需要更容易，更便宜和更容易获得的检测方法。在这里，我们描述了我们在最近的出版物（Papouin等人，2017b）中采用的安培法，基于生物传感器的方法。它可以对新鲜组织的D-丝氨酸水平进行可靠的测量，如急性脑切片，浓度高于100 nM，技术要求最低。
【背景】N-甲基D-天冬氨酸受体（NMDAR）是脑，脊髓和周围神经系统如肠神经元中神经递质谷氨酸的受体。在肾小管细胞和软骨细胞中也有发现。除谷氨酸外，NMDAR的激活需要在专用结合位点上结合共激动剂（Johnson和Ascher，1987; Kleckner和Dingledine，1988）。非常规氨基酸D-丝氨酸是神经系统众多区域中NMDAR的内源性共激动剂（参见Papouin等人，2017a）。在肝脏和肾脏中也可以发现其丰富的降解和排泄（Montesinos ...
|
|
|