| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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| Phagocytosis Assay for α-Synuclein Fibril Uptake by Mouse Primary Microglia
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Microglia are professional phagocytes in the brain and deficiency in their phagocytic activity plays an important role in Parkinson’s disease. This protocol mainly describes the phagocytosis assay for uptake of α-synuclein preformed fibrils, a pathologic form of α-synuclein, by primary microglia.
[摘要] 小胶质细胞是大脑中的专业吞噬细胞，其吞噬活性的缺乏在帕金森病中起重要作用。 该方案主要描述了通过原代小胶质细胞摄取α-突触核蛋白预先形成的原纤维（α-突触核蛋白的病理形式）的吞噬作用测定。
【背景】作为大脑的免疫细胞，小胶质细胞在中枢神经系统中起着关键作用。在生理状态下，小胶质细胞不断探索周围环境并参与突触修剪。小胶质细胞可被任何类型的病理事件或脑内稳态的变化激活（Wolf et al。，2017）。激活后，小胶质细胞经历形态学变化，增殖，分泌炎性细胞因子，迁移至病变部位，吞噬病原体，病细胞，碎片，甚至细胞外蛋白质聚集体（Kettenmann et al。，2011; Fu et al。，2014）。 α-突触核蛋白是神经元中的丰富蛋白质，并且是帕金森病中称为路易体和路易神经突的神经元内包涵体的主要成分（Luk 等人，，2012）。最近的研究表明α-突触核蛋白经历细胞间扩散，小胶质细胞是α-突触核蛋白的主要清除剂，它可能承担来自神经元的α-突触核蛋白的负担（Wolf et al。，2017 ）。在这里，我们描述了使用人α-突触核蛋白单体产生预先形成的原纤维并通过小胶质细胞吞噬作用测量α-突触核蛋白预先形成的原纤维的摄取的方案（Du et al。，2017）。
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| Immunogold Electron Microscopy of the Autophagosome Marker LC3
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Even though autophagy was firstly observed by transmission electron microscopy already in the 1950s (reviewed in Eskelinen et al., 2011), nowadays this technique remains one of the most powerful systems to monitor autophagic processes. The autophagosome, an LC3-positive double membrane structures enclosing cellular materials, represents the key organelle in autophagy and its simple visualization and/or numeration allow to draw important conclusions about the autophagic flux. Therefore, the accurate identification of autophagosomes is crucial for a comprehensive and detailed dissection of autophagy. Here we present a simple protocol to identify autophagosomes by transmission electron microscopy coupled to immunogold labeling of LC3 starting from a relatively low cell number, which ...
[摘要] 尽管早在20世纪50年代就已经通过透射电子显微镜观察了自噬（在Eskelinen等人2011年的综述中），但是现在这种技术仍然是监测自噬过程的最强大的系统之一。 自噬体是包含细胞物质的LC3阳性双层膜结构，代表了自噬的关键细胞器，其简单的可视化和/或计数允许得出关于自噬流的重要结论。 因此，准确鉴定自噬体对自噬的全面和详细的分析至关重要。 在这里我们提出一个简单的协议，以确定autophagosomes透射电子显微镜耦合LC3的免疫金标记从一个相对较低的细胞数量，我们最近开发遵循病毒介导的人类癌变期间的自噬途径。
【背景】自噬体代表了macroautophagy的关键结构，这是一种细胞胞质成分的分解代谢系统。巨自噬（或简单地自吞噬）由吞噬细胞的形成引发，所述吞噬细胞能够自身扩张吞噬细胞器和蛋白质，所述蛋白质最终闭合在螯合成分周围形成被称为自噬体的细胞器。接下来，在成熟过程中，自噬体可以与溶酶体融合以形成自溶酶体，其中被捕获的物质被位于溶酶体限制性膜中的泵降解并再循环回（Glick et al。，2010）。
由于自噬功能障碍与各种人类疾病，病毒感染，神经退行性疾病，免疫功能和癌症有关（Schneider and ...
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