| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
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| Mammalian Cell-derived Vesicles for the Isolation of Organelle Specific Transmembrane Proteins to Conduct Single Molecule Studies
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Cell-derived vesicles facilitate the isolation of transmembrane proteins in their physiological membrane maintaining their structural and functional integrity. These vesicles can be generated from different cellular organelles producing, housing, or transporting the proteins. Combined with single-molecule imaging, isolated organelle specific vesicles can be employed to study the trafficking and assembly of the embedded proteins. Here we present a method for organelle specific single molecule imaging via isolation of ER and plasma membrane vesicles from HEK293T cells by employing OptiPrep gradients and nitrogen cavitation. The isolation was validated through Western blotting, and the isolated vesicles were used to perform single molecule studies of oligomeric receptor assembly.
[摘要] 细胞衍生的囊泡促进跨膜蛋白在其生理膜中的分离，从而维持其结构和功能完整性。 这些囊泡可以由产生，容纳或运输蛋白质的不同细胞器产生。 结合单分子成像，可以使用分离的细胞器特异性囊泡来研究嵌入蛋白质的运输和组装。 在这里，我们提出了一种通过使用OptiPrep梯度和氮气穴通过从HEK293T细胞中分离ER和质膜囊泡来进行细胞器特异性单分子成像的方法。 通过Western印迹验证分离，并使用分离的囊泡进行寡聚受体组装的单分子研究。
【背景】大量的跨膜蛋白通过多个亚基的组装形成，导致复杂的寡聚结构，其可以通常以多种化学计量存在。了解组装中的变化如何改变在不同细胞器中的贩运和本地化对于确定蛋白质的生理作用以及与成熟和运输相关的疾病的连接至关重要。单分子方法可以通过直接测量其化学计量比来更好地理解寡聚蛋白的组装（Ulbrich和Isacoff，2007; Richards等人，2012）。这种方法避免了整体平均，从而提供了所有化学计量的平均状态（Walter and Bustamante，2014）。单分子研究近来已被用于理解大分子的结构和功能特性，包括构象动力学（Tan等人，2014），离子通道门控（Wang等人 ，2016），配体 - 受体相互作用（Moonschi等人，2015）和化学计量组装（Ulbrich和Isacoff，2007; ...
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