| Delivery of the Cas9 or TevCas9 System into Phaeodactylum tricornutum via Conjugation of Plasmids from a Bacterial Donor
|
|
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Diatoms are an ecologically important group of eukaryotic microalgae with properties that make them attractive for biotechnological applications such as biofuels, foods, cosmetics and pharmaceuticals. Phaeodactylum tricornutum is a model diatom with defined culture conditions, but routine genetic manipulations are hindered by a lack of simple and robust genetic tools. One obstacle to efficient engineering of P. tricornutum is that the current selection methods for P. tricornutum transformants depend on the use of a limited number of antibiotic resistance genes. An alternative and more cost-effective selection method would be to generate auxotrophic strains of P. tricornutum by knocking out key genes involved in amino acid biosynthesis, and using ...
[摘要] 硅藻是一种具有重要生态意义的真核微藻类，其特性使其对生物燃料，食品，化妆品和药品等生物技术应用具有吸引力。 Phaeodactylum tricornutum 是具有确定培养条件的模型硅藻，但缺乏简单而强大的遗传工具阻碍了常规遗传操作。有效设计 P的一个障碍。 tricornutum 是 P的当前选择方法。 tricornutum 转化体依赖于使用有限数量的抗生素抗性基因。另一种更具成本效益的选择方法是产生 P的营养缺陷型菌株。通过敲除参与氨基酸生物合成的关键基因，并使用基于质粒的生物合成基因拷贝作为选择标记，使三角酵母。以前关于 P基因敲除的研究。 tricornutum 使用biolistic转换将CRISPR-Cas9系统传递到 P.藻。非复制质粒的生物射弹转化可导致对 P的不期望的损伤。由于转化的DNA随机整合到基因组中，tricornutum 。随后固化编辑的细胞以防止Cas9的长期过表达是非常困难的，因为目前没有方法来切除整合的质粒。该协议采用新方法将Cas9或TevCas9系统传送到 P. tricornutum 通过来自细菌供体细胞的质粒的缀合。该过程涉及：1）设计和插入靶向 P的guideRNA。将tricornutum 尿素酶基因导入TevCas9表达质粒，该质粒也编码转移的接合起点，2）将该质粒安装在含有含有接合机制的质粒（pTA-Mob）的大肠杆菌中， ...
|
|
|
| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use of sensitized emission. Any widefield microscope capable of sensitive single molecule detection of Cy3 and Cy5 should be able to measure FRET in yeast cells. Alternatively, a FRET-FISH method can be ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
|
|
|
| Single-probe RNA FISH in Yeast
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a single fluorophore to quantify the amount of transcripts inside budding yeast cells. In addition to allowing the quantification of short transcripts or short features of transcripts, this technique ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交（FISH）技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而，许多情况下，如转录本短于200 nt，剪接变异，或创建转录本的替代起始位点，这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此，我们调整了标准FISH方案，以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外，该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号（Raj和Tyagi，2010）。 使用该方案，不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而，在大多数实验中，绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列，可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时，单个探针的检测效率大于50％（Wadsworth等人，2017）。
|
|
|