| Fluorescent Polysome Profiling in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] An important but often overlooked aspect of gene regulation occurs at the level of protein translation. Many genes are regulated not only by transcription but by their propensity to be recruited to actively translating ribosomes (polysomes). Polysome profiling allows for the separation of unbound 40S and 60S subunits, 80S monosomes, and actively translating mRNA bound by two or more ribosomes. Thus, this technique allows for actively translated mRNA to be isolated. Transcript abundance can then be compared between actively translated mRNA and all mRNA present in a sample to identify instances of post-transcriptional regulation. Additionally, polysome profiling can be used as a readout of global translation rates by quantifying the proportion of actively translating ribosomes within a ...
[摘要] [摘要 ] 基因调控的一个重要但经常被忽视的方面发生在蛋白质翻译的水平。许多基因不仅受转录调控，还受其被募集以主动翻译核糖体（多核糖体）的倾向性的调节。多核糖体分析允许分离未结合的40S和60S亚基，80S单核糖体，并主动翻译由两个或多个核糖体结合的mRNA。因此，该技术允许分离出主动翻译的mRNA。然后可以在主动翻译的mRNA和样品中存在的所有mRNA之间比较转录本丰度，以鉴定转录后调控的实例。此外，多核糖体分析可以用作ar 通过量化样品中活性翻译核糖体的比例来确定总体翻译率。先前建立的多核糖体谱分析方案依赖于RNA的吸收来可视化级分中多核糖体的存在。但是，随着能够检测荧光的流通池的出现，除了RNA的吸收以外，还可以检测和定量荧光标记的蛋白质与多核糖体的结合。该协议提供了有关如何在秀丽隐杆线虫中进行荧光多核糖体分析以收集主动翻译的mRNA，定量整体翻译的变化以及检测核糖体结合伴侣的详细说明。
[背景 ] 绑定到同一个mRNA转录多积极核糖体的翻译被称为多聚核糖体。可使用多核糖体分析将多核糖体与其他核糖体形式和未结合的mRNA分离。P olysome 分析已经在蛋白质翻译领域的关键技术。与mRNA的-SEQ的同时，多边形OME分析允许由转录后机制调节以进行检测和定量转录物（兰等人，2019;罗林。等人，2019） ，通过定量PCR （熊猫等人， ...
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| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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