| Viral Double-Stranded RNA Detection by DNase I and Nuclease S1 digestions in Leishmania parasites
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Many RNA viruses are found in protozoan parasites. They can be responsible for more serious pathology or treatment failure. For the detection of viral double-stranded RNA (dsRNA), sequence-dependent and -independent methods are available, such as quantitative real-time PCR and immunofluorescence, dot blot, ELISA or sequencing. The technique presented here is sequence-independent and is well detailed in the following protocol, taking the example of Leishmania RNA virus (LRV) in Leishmania guyanensis (Lgy) species. To summarise, the protocol is divided into four major steps: RNA extraction from the parasites, RNA purification, enzymatic digestions with DNase I and Nuclease S1, and visualization by gel electrophoresis. This method can be used to detect other viral ...
[摘要] [摘要 ] 原生动物寄生虫中发现了许多RNA病毒，它们可能导致更严重的病理或治疗失败。对于病毒双链RNA（dsRNA）的检测，有序列依赖性和非依赖性方法，例如定量实时PCR和免疫荧光，斑点印迹，ELISA或测序。此处介绍的技术是与序列无关的，并且在以下协议中进行了详细说明，以利什曼原虫（Legymania guyanensis）（Lgy ）中的利什曼原虫RNA病毒（LRV）为例 概括地说，该协议分为四个主要步骤：从寄生虫中提取RNA，RNA纯化，使用DNase I和Nuclease S1进行图解消化以及通过凝胶电泳进行可视化。该方法可用于检测其他病毒dsRNA它提供了一个额外的工具，可以对先前引用的其他技术进行补充，并且很容易实现。
[背景 ] 广泛的多样性RNA病毒中存在的原生动物寄生虫一直都有详细记载（王和王，1991;戈什等人，2011;桑戈等人。2014;碱液等人，2016年Akopyants 等人2016 ; Fernandez- Presas 等人，2017; Grybchuk 。等人。，2018）。此外，这些病毒已经被描述为潜在的毒力因子（Fichorova 等人，2013; EL- Gayar 。等人，2016; 拉特等。，2019）特别值得注意的，存在的内共生体。利什曼原虫RNA病毒（LRV），A ...
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| α-Synuclein Aggregation Monitored by Thioflavin T Fluorescence Assay
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Date:
2018-07-20
[Abstract] Studying the aggregation of amyloid proteins like α-synuclein in vitro is a convenient and popular tool to gain kinetic insights into aggregation as well as to study factors (e.g., aggregation inhibitors) that influence it. These aggregation assays typically make use of the fluorescence dye Thioflavin T as a sensitive fluorescence reporter of amyloid fibril formation and are conducted in a plate-reader-based format, permitting the simultaneous screening of multiple samples and conditions. However, aggregation assays are generally prone to poor reproducibility due to the stochastic nature of fibril nucleation and the multiplicity of modulating factors. Here we present a simple and reproducible protocol to study the aggregation of α-synuclein in a plate-reader based assay.
[摘要] 研究淀粉样蛋白如α-突触核蛋白体外聚集是一种方便和流行的工具，可以获得聚集的动力学见解以及研究因子（例如，聚集抑制剂） 影响它。 这些聚集测定通常利用荧光染料硫磺素T作为淀粉样蛋白原纤维形成的敏感荧光报告物，并且以基于读板器的形式进行，允许同时筛选多个样品和条件。 然而，由于原纤维成核的随机性质和调节因子的多样性，聚集测定通常倾向于较差的再现性。 在这里，我们提出了一个简单和可重复的协议，以研究基于读板器的测定中α-突触核蛋白的聚集。
【背景】内源性蛋白质与淀粉样原纤维的聚集是一种致病过程，与几种疾病相关，例如，神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）以及全身性疾病如AL淀粉样变性（ Knowles et al。，2014）。通过基于硫磺素T荧光的聚集测定，可以在基于板读者的装置中在体外中概括该过程，从而允许根据各种影响因素研究淀粉样蛋白的聚集动力学。
硫磺素T（ThT）是一种荧光染料，最初用于组织学样本中的淀粉样蛋白原纤维染色，于1959年由Vassar和Culling（Vassar和Culling，1959），其在体外检测和定量淀粉样纤维的应用
目前，硫代黄素T的聚集测定主要在荧光板读数器中进行，其中例如，96条件可以同时测试。由于原纤维成核的随机性质和影响蛋白质聚集的多种因素，这些测定法具有较差的重现性。因此，已经采用了增加ThT测定的再现性的策略，例如在测量期间使用井板的轨道摇动以及向孔中添加玻璃珠以改善混合（Giehm和Otzen，2010）。 ...
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| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and over-expressed proteins localizing to the delicate cellular structures.
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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