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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] The efficiency of cleavage of individual CRISPR/Cas9-sgRNAs remains difficult to predict based on the CRISPR target sequence alone. Different intracellular environments (dependent on cell type or cell cycle state for example) may affect sgRNA efficiency by altering accessibility of genomic DNA through DNA modifications such as epigenetic marks and DNA-binding proteins (e.g., histones) as well as alteration of the chromatin state of genomic DNA within the nucleus.
We recently reported a multi-step screening method for the identification of efficient sgRNAs targeting the Herpes simplex virus (HSV-1) genome and reported a differential mechanism for viral inhibition by CRISPR-Cas9 in the latent versus lytic phase. The screening platform detailed in this protocol allows ...
[摘要] [摘要 ] 单独基于CRISPR靶序列仍难以预测单个CRISPR / Cas9-sgRNA的切割效率。不同的细胞内环境（例如，取决于细胞类型或细胞周期状态）可能会通过DNA修饰（例如表观遗传标记和DNA结合蛋白（例如组蛋白））和染色质状态的改变来改变基因组DNA的可及性，从而影响sgRNA效率。核内基因组DNA的标记。
我们recen TLY 报道的多步骤方法筛选用于有效sgRNAs靶向的识别的单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，并报告为在潜对裂解病毒相抑制CRISPR-Cas9的差动机构。该协议中详述的筛选平台允许在无细胞系统中以及在病毒靶细胞（例如人包皮成纤维细胞）的背景下逐步测试切割效率，然后对CRISPR / sgRNA的作用进行功能测试病毒蛋白的表达，复制，和再活化。该策略可以容易地应用于其他靶细胞，例如多能干细胞衍生的人感觉神经元或其他人DNA病毒。
背景 ] 单纯疱疹病毒（HSV）是的一种嗜神经性DNA病毒疱疹病毒科家族引起终身和无法治愈感染在大多数人群的，并可能导致显著发病率和死亡率（Liesegang环等人，1989; Roizman 等人。，2013） ...
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Nucleocytoplasmic transport deficits are suggested to play a role in neurodegenerative disorders, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Given the importance and complexity of this process, understanding when these aberrations occur and which pathways are involved is of great importance. Here, we make use of CRISPR-Cas9 technology to design cell lines stably expressing fluorophore proteins shuttling between the nucleus and cytoplasm by karyopherins of choice. To validate this protocol, we measured an ALS-associated nucleocytoplasmic transport pathway in the presence of the disease-associated peptide poly-PR. This technique allows measuring a particular active nucleocytoplasmic transport pathway in intact cells in a neurodegenerative disease-associated context. Moreover, these ...
[摘要] [摘要]核细胞质运输缺陷被认为在神经退行性疾病中发挥作用，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）。鉴于这一过程的重要性和复杂性，了解这些畸变何时发生以及涉及哪些途径是非常重要的。在这里，我们利用CRISPR-Cas9技术来设计细胞系，稳定地表达荧光素蛋白在细胞核和细胞质之间穿梭的选择的卡里菲林。为了验证这个协议，我们测量了一个ALS相关的核细胞质运输途径，在疾病相关的多肽poly-PR的存在。这种技术允许测量在神经退行性疾病相关的背景下，在完整细胞中的一个特定的活性核细胞质运输途径。此外，这些实验可以在不需要昂贵的设备的情况下进行，并有可能升级为高通量筛选目的。
[背景]核细胞质运输对细胞稳态至关重要，并通过形成水通道的大型多蛋白复合物穿过核膜，称为核孔复合物（NPCs）（Stoffler et al., 1999; Ryan and Wente, 2000)。虽然这些通道允许小蛋白被动地平衡穿过核膜（被动运输），但大多数蛋白质似乎是由核素主动运输的，即进口蛋白或出口蛋白（主动运输）。含有核定位信号(NLS)的货物蛋白被导入素所定位。已经确定了各种受体介导的导入途径，但最有特色的途径涉及导入素-β1/导入素-α(KPNB1/KPNAx)，其中货蛋白含有经典的NLS(cNLS)，以SV40大T抗原NLS为例(Lange et al., ...
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