| Fluidigm Based Single-cell Gene Expression Library Preparation from Patient-derived Small Intestinal Organoids
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Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe our methods to isolate crypts from patients' biopsy samples and to culture human intestinal stem cells as it’s called “organoid.” Beyond that, we describe how to dissociate organoids cells into single cells for single-cell analysis as a further application. This protocol should provide investigators sufficient tools to generate human organoids from biopsy samples and to accomplish a stable in-vitro assay system.
[摘要] [摘要]在此协议中，我们描述了从患者的活检样本中分离隐窝并培养人类肠干细胞（称为“类器官”）的方法。除此之外，我们还介绍了如何将类器官细胞分解为单细胞以进行单细胞分析，作为进一步的应用。该方案应为研究人员提供足够的工具，以从活检样品中产生人类器官并完成稳定的体外测定系统。
[背景]肠上皮是一个多功能组织即编排动态平衡并形成物理屏障。由肠干细胞（ISC）产生的每个肠上皮细胞（IEC）每4-5天更新一次该上皮（Crosnier等，2006 ）。ISC位于隐窝的底部，并表达各种文献先前报道的特定标记（Muñoz等，2012 ；Clevers ，2013 ）。研究表明，干细胞正确更新的功能障碍与肠道疾病有关，对ISCs动态的了解可能阐明了包括炎症性肠病（IBD）在内的各种疾病的发病机制（Okamoto et al。，2016 ）。
然而，由于缺乏能概括生理性肠上皮层的有效模型，因此对肠干细胞特性的研究具有挑战性。史诗般的“类器官”的引入克服了种种障碍（Sato等人，2009和2011 ），可以从单个ISC体外建立类器官，并忠实地保留其起源组织的生理和病理特征（Middendorp等人）。 。，2014 ）。类器官已被用于各种胃肠道疾病解剖基础病理变化（Fatehullah 。等人，2016; Noben等人，2017 ...
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| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and over-expressed proteins localizing to the delicate cellular structures.
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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