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Promega pGEM-T Easy Vector
Company: Thermo Fisher Scientific
Catalog#: A1360
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Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract]  The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary DNA ligase to add a double stranded DNA oligonucleotide onto the 3′ end of cDNA while it is base paired with mRNA. Specificity for capped ends is obtained by the oligonucleotide having an unpaired C ... [摘要]  [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中，并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法，使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶，在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸，同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序（如果是单个带）或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物，也可以用于Illumina库测序。

[背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中，并开发了许多全基因组技术（例如，基因表达的Capped分析，或CAGE）（Morioka等人，2020年），这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外，约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游（Djebali等人，2012年）。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定：一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上，但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上（Otsuka等人，2009年）。细胞质封顶由一种复合酶催化，包括封盖酶（RNGTT）、帽甲基转移酶（RNMT）及其激活亚单位（RAM），以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶（Trotman和Schoenberg，2019）。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本，其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近（Kiss等人，2015年；Berger等人，2019年）。虽然令人鼓舞，但这种方法有三个主要缺点：a）它需要分离带帽和未封顶的rna，b）它假设未封顶的转录本保持足够稳定，可以被检测到，以及c）它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...

Rolling Circle Amplification to Screen Yam Germplasm for Badnavirus Infections and to Amplify and Characterise Novel Badnavirus Genomes
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract]  Since the first discovery of badnaviruses (family Caulimoviridae, genus Badnavirus) in yam (Dioscorea spp.) germplasm in the 1970s (Harrison and Roberts, 1973), several hundred partial badnavirus reverse transcriptase (RT)-ribonuclease H (RNaseH) sequences have been characterised (Kenyon et al., 2008; Bousalem et al., 2009), but only a few complete Dioscorea bacilliform virus (DBV) genome sequences have been reported (Phillips et al., 1999; Seal and Muller, 2007; Bömer et al., 2016 and 2017; Sukal et al., 2017; Umber et al., 2017). We have optimised a workflow involving total nucleic acid extractions and rolling circle amplification (RCA) combined with restriction enzyme analysis for the detection ... [摘要]  自二十世纪七十年代山药（Dioscorea spp。）种质中首次发现坏病毒属（家庭花椰菜科，属于病毒属）之后（Harrison和Roberts， 1973），已经表征了数百个部分坏死病毒逆转录酶（RT） - 核糖核酸酶H（RNaseH）序列（Kenyon等人，2008; Bousalem等人，2009年），但仅有少数几种完整的Dioscorea杆状病毒（DBV）基因组序列已被报道（Phillips等，1999; Seal和Muller，2007;Bömer等， 2016和2017; Sukal等人，2017; Umber等人，2017）。我们优化了总核酸提取和滚环扩增（RCA）结合限制性酶分析的工作流程，以检测和扩增山药种质中存在的DBV。我们已经使用这种方法成功地揭示了三种新型附加体阴性坏死病毒（Bömer等人，2016年）。我们提出这是变性梯度凝胶电泳的补充方法，其能够快速指示坏死病毒多样性以及在宿主基因组中鉴定潜在整合的坏死病毒序列（Turaki等人，2017年） ）。在这里，我们描述了一步一步的方案来筛选山药种质的坏死病毒感染使用RCA作为一个有效的研究工具，在扩增和表征的新型坏死病毒基因组。

【背景】RCA是经常用于扩增环状DNA病毒基因组的序列无关的策略（Rector等人，2004）。 Phi29聚合酶介导的RCA技术用于（i）检测新型病毒; ...

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