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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included intra-nucleosomal H3 crosslinking using dimethyl suberimidate (DMS). Here, we provide a detailed protocol for the use of DMS to analyze yeast nucleosomes.
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The combination of immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy (LSM) is essential to high-resolution detection of molecular distribution in biological specimens. A frequent limitation is the need to image deep inside a tissue or in a specific plane, which may be inaccessible due to tissue size or shape. Recreating high-resolution 3D images is not possible because the point-spread function of light reduces the resolution in the Z-axis about 3-fold, compared to XY, and light scattering obscures signal deep in the tissue. However, the XY plane of interest can be chosen if embedded samples are precisely oriented and sectioned prior to imaging (Figure 1). Here we describe the preparation of frozen tissue sections of the Drosophila wing imaginal disc, which allows us to ...
[摘要] 免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜（LSM）的组合是高分辨率检测生物样品中分子分布的关键。频繁的限制是需要在组织内或在特定的平面深处进行成像，这可能由于组织大小或形状而不可接近。因为与XY相比，光的点扩散函数将Z轴的分辨率降低了约3倍，并且光散射使组织中的深层信号模糊，所以不可能重新创建高分辨率3D图像。然而，如果嵌入的样品在成像之前被精确地定向和切片，则可以选择感兴趣的XY平面（图1）。在这里，我们描述的果蝇翅成像光盘的冰冻组织切片的准备，这使得我们能够获得高分辨率的图像，在整个这个折叠上皮的深度。
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图1.上皮结构和未畸变的折叠模式在发育果蝇翅膀的这个冰冻部分的整个深度中都被揭示出来。通过机翼囊横向背腹节。 A.冷冻切片显示贯穿上皮深度的信号的α-连环蛋白（A'，A“，洋红色）的细胞核（A，绿色）和亚细胞分布。基底表面清晰可辨（箭头）。 A是“A的数字增强图像”。 B.在显示为XZ正交视图的自顶向下视图中收集的图像的Z-堆叠揭示了α-连环蛋白（B'，B“）甚至数字增强图像（B”）的细胞核（B）但很少可辨别的细节。未能揭示基底上皮表面（箭头）。 ...
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